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1、背景:
骨質(zhì)疏松癥是一種典型的老年性疾病,伴隨著極高的發(fā)病率和死亡率并且顯著的降低患者的生存質(zhì)量,目前已經(jīng)發(fā)展成為一個(gè)普遍的公眾健康問(wèn)題。骨質(zhì)疏松癥是以低骨量、骨組織微結(jié)構(gòu)被破壞為特點(diǎn)的疾病,容易導(dǎo)致骨骼脆性增加并且誘發(fā)骨折。其診斷主要依靠骨密度檢查,T值≤-2.5或者伴隨脆性骨折即可確診。在女性人群中,骨質(zhì)疏松癥和骨折的發(fā)生主要是由于絕經(jīng)后雌激素水平的下降、破骨細(xì)胞參與的骨吸收和成骨細(xì)胞參與的骨形成之間的平衡被破壞以及骨量減
2、少共同導(dǎo)致的。目前骨質(zhì)疏松癥的治療方向主要集中在恢復(fù)和維持骨吸收和骨形成之間的平衡,臨床上普遍采用藥物治療,包括抑制骨吸收藥物和促進(jìn)骨形成藥物。除此之外,考慮到鈣在骨代謝和骨平衡中發(fā)揮著重要作用,而且大部分女性的日常鈣攝入量只有推薦攝入量的一半甚至更低,補(bǔ)充鈣劑和維生素D也成為預(yù)防和治療骨質(zhì)疏松癥的一個(gè)普遍方法,在臨床治療中廣泛采用。近年來(lái),越來(lái)越多的研究發(fā)現(xiàn)補(bǔ)鈣并沒(méi)有達(dá)到預(yù)期的治療骨質(zhì)疏松癥和預(yù)防骨折的效果,不僅如此,還會(huì)引起心血管和
3、胃腸道等系統(tǒng)的并發(fā)癥,其潛在的具體原因和作用機(jī)制引發(fā)了更多的關(guān)注。近來(lái)有研究發(fā)現(xiàn)雌激素可以參與并調(diào)控部分鈣通道的功能,我們推測(cè)絕經(jīng)后婦女是否因?yàn)榇萍に厝狈σ鸩糠肘}通道功能失調(diào)從而導(dǎo)致鈣離子無(wú)法正常出入細(xì)胞發(fā)揮作用,因此影響補(bǔ)鈣對(duì)骨質(zhì)疏松癥的預(yù)防和治療效果。鈣釋放激活鈣通道(Ca2+release activated Ca2+channel,CRAC)是最近發(fā)現(xiàn)的細(xì)胞受體依賴(lài)型鈣離子內(nèi)流鈣通道,可以感受細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)鈣釋放而引起鈣內(nèi)流,ST
4、IM1和Orai1是其組成部分,分別位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和質(zhì)膜上,STIM1可以感受內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣庫(kù)的釋放并參與調(diào)控胞膜Orai1孔隙鈣通道的開(kāi)放。研究發(fā)現(xiàn)Orai1參與調(diào)控成骨細(xì)胞和破骨細(xì)胞的分化過(guò)程,而STIM1在其中的作用和具體功能還有待探索。本研究從絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化能力和STIM1表達(dá)和功能的狀態(tài)入手,深入探討STIM1參與成骨分化的調(diào)控以及雌激素對(duì)STIM1的調(diào)控及其作用機(jī)制。該研究初步探索了鈣釋放激活鈣通道和ST
5、IM1在成骨分化方面的作用和機(jī)制,進(jìn)一步闡述了絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展的原因,開(kāi)闊了臨床中骨質(zhì)疏松癥治療和預(yù)防的思路,提供了新的藥物靶點(diǎn)和治療策略。
目的:
闡明STIM1調(diào)控成骨細(xì)胞分化及參與絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥發(fā)生發(fā)展的機(jī)制
方法:
1.通過(guò)臨床取材獲得并培養(yǎng)絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,加入成骨誘導(dǎo)液成骨誘導(dǎo)14天,檢測(cè)成骨分化關(guān)鍵因子Alp、Ocn、Opn和Collagen1的轉(zhuǎn)錄水平
6、及堿性磷酸酶活性和礦物沉積能力;檢測(cè)STIM1表達(dá)與鈣離子內(nèi)流的變化,明確絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞STIM1表達(dá)、CRAC功能狀態(tài)以及成骨分化能力有無(wú)異常。
2.通過(guò)構(gòu)建STIM1穩(wěn)定knockdown細(xì)胞模型,在成骨誘導(dǎo)過(guò)程中檢測(cè)成骨分化關(guān)鍵指標(biāo)Alp、Ocn、Opn、Collagen1、Runx2、Osterix轉(zhuǎn)錄水平以及堿性磷酸酶活性和鈣結(jié)節(jié)形成能力,明確STIM1在成骨細(xì)胞成骨分化和骨形成中的作用。
7、> 3.采用雌激素刺激小鼠成骨細(xì)胞系,檢測(cè)STIM1蛋白表達(dá)與mRNA轉(zhuǎn)錄水平,明確雌激素和STIM1之間的聯(lián)系;抑制PI3K-mTOR信號(hào)通路活性后,檢測(cè)雌激素對(duì)STIM1表達(dá)的影響,進(jìn)一步驗(yàn)證雌激素調(diào)控STIM1的具體機(jī)制和信號(hào)通路。
4.通過(guò)對(duì)STIM1 knockdown細(xì)胞模型加入雌激素刺激,檢測(cè)成骨誘導(dǎo)過(guò)程中成骨分化關(guān)鍵因子Alp、Ocn、Opn、Collagen1、Runx2、Osterix轉(zhuǎn)錄水平及堿性磷酸酶
8、活性和胞外礦物沉積能力,明確STIM1是否參與雌激素調(diào)控的成骨細(xì)胞成骨分化過(guò)程。
結(jié)果:
1.我們通過(guò)臨床手術(shù)獲取絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分離并培養(yǎng),在成骨誘導(dǎo)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)成骨分化關(guān)鍵指標(biāo)Alp、Ocn、Opn和Collagen1轉(zhuǎn)錄水平以及堿性磷酸酶活性和鈣結(jié)節(jié)形成能力均下降,STIM1表達(dá)下降并且鈣離子內(nèi)流減少。提示絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞CRAC狀態(tài)和功能異常,成骨分化能力降低。
9、 2.我們應(yīng)用shRNA干擾技術(shù)在小鼠MC3T3-E1細(xì)胞中成功構(gòu)建STIM1穩(wěn)定knockdown細(xì)胞模型,在成骨誘導(dǎo)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)抑制STIM1的表達(dá)后,成骨分化關(guān)鍵指標(biāo)Alp、Ocn、Opn、Collagen1、Runx2和Osterix轉(zhuǎn)錄水平及堿性磷酸酶活性和鈣結(jié)節(jié)形成能力均下降,提示STIM1可通過(guò)促進(jìn)鈣內(nèi)流或其他方式進(jìn)而促進(jìn)成骨細(xì)胞的分化和功能。
3.通過(guò)加入雌激素刺激小鼠成骨細(xì)胞系我們發(fā)現(xiàn)STIM1的蛋白表達(dá)與轉(zhuǎn)
10、錄水平均升高;通過(guò)特異性抑制劑抑制特定信號(hào)通路PI3K-mTOR活性后,雌激素失去了對(duì)STIM1的上調(diào)作用,說(shuō)明雌激素可以通過(guò)PI3K-mTOR信號(hào)通路上調(diào)STIM1的表達(dá)。
4.通過(guò)構(gòu)建小鼠MC3T3-E1細(xì)胞STIM1穩(wěn)定knockdown細(xì)胞模型,我們發(fā)現(xiàn)抑制STIM1表達(dá)可明顯阻斷雌激素促進(jìn)成骨分化關(guān)鍵指標(biāo)Alp、Ocn、Opn、Collagen1、Runx2和Osterix轉(zhuǎn)錄及堿性磷酸酶活性和鈣結(jié)節(jié)形成能力的作用,
11、提示STIM1參與雌激素調(diào)控的成骨分化和骨形成過(guò)程。
結(jié)論:
綜上所述,我們的研究發(fā)現(xiàn)STIM1在成骨細(xì)胞的分化和功能中發(fā)揮重要作用,并且參與雌激素調(diào)控的成骨分化和骨形成過(guò)程。絕經(jīng)后由于雌激素水平下降導(dǎo)致STIM1轉(zhuǎn)錄水平和表達(dá)下降,間接影響了鈣釋放激活鈣通道的功能,降低了成骨細(xì)胞的成骨分化和骨形成能力,這可能是絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥的發(fā)生發(fā)展原因之一。該研究初步闡明了STIM1在成骨分化和骨形成方面的作用及其機(jī)制,可為進(jìn)
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