Jak2調(diào)控Th1-Treg細(xì)胞平衡對(duì)心臟移植排斥反應(yīng)的防治及機(jī)制研究.pdf

1、一、研究背景和目的
　　對(duì)于那些患有嚴(yán)重心臟疾病的病人來講，心臟移植手術(shù)是目前唯一能挽救他們生命并且提高其生活質(zhì)量的治療手段。但是和眾多器官移植手術(shù)類似，心臟移植術(shù)后的排斥反應(yīng)是影響移植心臟發(fā)揮正常功能及病人長(zhǎng)期存活的最大障礙。雖然免疫抑制劑的使用大大提高了心臟移植術(shù)后病人的生存率，但是不能忽視的是免疫抑制劑對(duì)機(jī)體存在毒副作用并會(huì)引起嚴(yán)重并發(fā)癥。近來，以調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Regulatory T cells, Treg）為基礎(chǔ)的細(xì)胞治

2、療方法因其能明顯減少移植物術(shù)后慢性排斥反應(yīng)且?guī)缀鯚o任何毒副作用而越來越受到科研界的追捧。然而，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的治療方案也存在著一些急需解決的問題，例如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞在體外較難擴(kuò)增，調(diào)節(jié)性T細(xì)胞存在不穩(wěn)定性以及抗原特異性等，這些都影響了其在臨床上的廣泛應(yīng)用。因此，更好的了解調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制以及探究影響調(diào)節(jié)性 T細(xì)胞生存發(fā)育的重要因素對(duì)于其在臨床上的安全應(yīng)用及推廣至關(guān)重要。
　　作為非受體酪氨酸蛋白激酶，哺乳動(dòng)物Jak激酶家族包

3、括四個(gè)進(jìn)化保守的成員：Jak1，Jak2，Jak3和Tyk2。Jak/STAT作為細(xì)胞因子的主要信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，在免疫應(yīng)答和免疫反應(yīng)的產(chǎn)生過程中都發(fā)揮關(guān)鍵的作用。當(dāng)細(xì)胞因子與相關(guān)細(xì)胞表面受體結(jié)合后會(huì)活化Jak激酶家族，導(dǎo)致Jak激酶在酪氨酸殘基上發(fā)生自身磷酸化，進(jìn)而產(chǎn)生錨定位點(diǎn)致使信號(hào)傳導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄活化因子（STAT）發(fā)生磷酸化。經(jīng)Jak激活的磷酸化STAT成員接下來會(huì)組成同源二聚體或者異源二聚體，這些二聚體會(huì)發(fā)生核轉(zhuǎn)位，進(jìn)而調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答基因

4、的表達(dá)。值得注意的是，最近有研究表明針對(duì) Jak3的特異性抑制劑可以作為免疫抑制劑，用于治療移植免疫排斥反應(yīng)和自身免疫性相關(guān)疾病。然而由于IL-2-Jak3-STAT5信號(hào)通路對(duì)于Treg細(xì)胞至關(guān)重要，因此當(dāng)Jak3被抑制后會(huì)導(dǎo)致對(duì)移植物有保護(hù)作用的Treg細(xì)胞同時(shí)被抑制，這也是限制此種治療方法廣泛應(yīng)用于預(yù)防和治療臨床上移植物急慢性排斥反應(yīng)的主要原因。
　　Jak激酶家族另外一個(gè)重要成員，Jak2激酶參與調(diào)控了許多生命活動(dòng)，例如：

5、細(xì)胞的增殖，活化以及分化等。與Jak3激酶不同的是，現(xiàn)在對(duì)Jak2激酶功能的研究主要集中在 V617F功能獲得性突變與惡性血液病的相關(guān)性研究。體外實(shí)驗(yàn)表明，Jak2對(duì)于 IL-3，IL-5，IL-12，IFN-γ以及單核巨噬細(xì)胞集落刺激因子（GM-CSF）等信號(hào)通路至關(guān)重要。種種跡象表明 Jak2可能參與體內(nèi)的免疫應(yīng)答,因此我們從美國(guó)Kay-Uwe Wagner教授實(shí)驗(yàn)室引進(jìn)了一種條件誘導(dǎo)性敲除Jak2基因的小鼠品系，以此來研究 Jak

6、2激酶在免疫細(xì)胞中的作用。本實(shí)驗(yàn)室之前的研究發(fā)現(xiàn)，在固有免疫應(yīng)答中，成年小鼠條件性敲除Jak2基因后，會(huì)導(dǎo)致樹突狀細(xì)胞（DC）的發(fā)育和成熟障礙。但是，Jak2激酶缺失對(duì)適應(yīng)性免疫應(yīng)答的影響，尤其是對(duì)輔助性T細(xì)胞各亞群的影響，我們還是不甚了解。因此，在本實(shí)驗(yàn)中我們用成年誘導(dǎo)性Jak2基因敲除的SPF級(jí)小鼠，運(yùn)用小鼠異系異位心臟移植模型探討 Jak2激酶在適應(yīng)性免疫應(yīng)答中的作用及其機(jī)制。在實(shí)驗(yàn)中，發(fā)現(xiàn) Jak2基因缺失對(duì)于同種異系心臟移植后

7、的排斥反應(yīng)有免疫保護(hù)作用，其機(jī)制主要是通過抑制具有促炎作用的Th1細(xì)胞亞群以及相對(duì)增加具有免疫調(diào)節(jié)作用的Treg細(xì)胞亞群來實(shí)現(xiàn)。
　　二、實(shí)驗(yàn)方法和結(jié)果：
　　首先給8周齡Cre+/+-Jak2fl/fl小鼠連續(xù)5天腹腔注射特莫西芬，誘導(dǎo)其特異性敲除Jak2基因。分析Jak2缺失小鼠發(fā)現(xiàn)，相對(duì)于對(duì)照組小鼠來說，Jak2基因缺失小鼠表現(xiàn)出明顯的脾臟細(xì)胞數(shù)量減少的現(xiàn)象。更有趣的是，我們用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Jak2基因缺失小鼠脾

8、臟細(xì)胞中，幾乎沒有髓系來源的細(xì)胞，這和我們之前研究發(fā)現(xiàn) Jak2基因缺失導(dǎo)致DC細(xì)胞生存發(fā)育障礙的結(jié)論一致,與此相反的是淋巴系來源的細(xì)胞比例明顯增多。和這一現(xiàn)象一致的是，CD4陽(yáng)性T細(xì)胞在脾臟總細(xì)胞中所占的比例相對(duì)于對(duì)照組來說增加了一倍。我們同時(shí)發(fā)現(xiàn) Jak2基因缺失小鼠的外周血中淋巴系細(xì)胞和CD4陽(yáng)性T細(xì)胞比例也明顯增高。
　　由于Jak2基因缺失會(huì)影響淋巴系來源細(xì)胞，那么接下來我們開始探討Jak2是具體影響到哪些T細(xì)胞亞型。我

9、們分別提取Jak2基因缺失和野生型小鼠脾臟細(xì)胞，通過流式抗體標(biāo)記CD3，CD4和CD8，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在CD3陽(yáng)性T細(xì)胞中，Jak2基因缺失并沒有改變CD4和CD8陽(yáng)性T細(xì)胞的比例，以上結(jié)果在淋巴結(jié)和外周血中也得了到證實(shí)。然而有趣的是，我們發(fā)現(xiàn)在Jak2基因缺失小鼠體內(nèi)，CD4+CD44high CD62Llow效應(yīng)或記憶性T細(xì)胞（TEM細(xì)胞）比例明顯降低，同時(shí)分泌IFN-γ的Th1細(xì)胞比例也明顯減少。與此相反的是，CD4+Foxp3+Tre

10、g細(xì)胞的比例在Jak2基因缺失后明顯升高。
　　接下來我們使用na?ve T細(xì)胞試劑盒分別從Jak2基因缺失小鼠和野生型小鼠的脾臟中分選出CD4+CD44lowCD62Lhigh naive T細(xì)胞，然后將這些細(xì)胞分別在Th1和Treg細(xì)胞培養(yǎng)環(huán)境中培養(yǎng)，最后用流式細(xì)胞術(shù)分別檢測(cè)IFN-γ陽(yáng)性T細(xì)胞和foxp3陽(yáng)性T細(xì)胞來確定Jak2激酶缺失是否會(huì)對(duì)na?ve T細(xì)胞的定向分化產(chǎn)生影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，野生型小鼠來源的na?ve T細(xì)胞

11、能夠很好的分化為分泌IFN-γ的Th1細(xì)胞，而Jak2基因缺失小鼠來源的na?ve T細(xì)胞幾乎不能分化為Th1細(xì)胞。為了進(jìn)一步確認(rèn)以上分化結(jié)果，我們?cè)赥h1細(xì)胞定向分化培養(yǎng)環(huán)境中又額外的加入了細(xì)胞因子IFN-γ，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞因子IFN-γ能夠進(jìn)一步提高WT小鼠來源的na?ve T細(xì)胞的定向分化能力，但是細(xì)胞因子IFN-γ并沒有逆轉(zhuǎn)由于Jak2基因缺失而導(dǎo)致的na?ve T細(xì)胞不能分化為Th1細(xì)胞的現(xiàn)象。有趣的是，與野生型小鼠相比，Jak

12、2基因缺失后不但沒有影響na?ve T細(xì)胞分化為Treg細(xì)胞，反而促進(jìn)了此過程。尤其是在Treg細(xì)胞定向分化培養(yǎng)環(huán)境中加入了抗CD28抗體刺激后，Jak2基因缺失小鼠來源的naive T細(xì)胞分化為Treg細(xì)胞的能力進(jìn)一步提高。
　　根據(jù)以上結(jié)果發(fā)現(xiàn), Jak2基因缺失后一方面抑制了Th1細(xì)胞的發(fā)育,另一方面又促進(jìn)了Treg細(xì)胞的分化發(fā)育，這讓我們聯(lián)想到Jak2激酶是否會(huì)參與同種異體移植物排斥反應(yīng)，因?yàn)檫@種排斥反應(yīng)主要是由CD4陽(yáng)性

13、T細(xì)胞介導(dǎo)。為了證明這個(gè)假設(shè)，我們運(yùn)用小鼠異系異位心臟移植模型，即將BABL/c(H-2d)來源的小鼠心臟移植到與其有不同遺傳背景(H-2b)的Jak2基因缺失小鼠或?qū)φ找吧虲57BL/6J(H-2b)小鼠的腹部。經(jīng)過觀察發(fā)現(xiàn)，Jak2基因敲除后相對(duì)于野生對(duì)照組來說能夠明顯延長(zhǎng)心臟移植物的存活時(shí)間（平均生存期為58±30.6天 vs.7±0.3天, p<0.001）。
　　接下來我們對(duì)小鼠移植后的心臟做了病理學(xué)檢查，由此來確定以

14、上實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性。我們?cè)谛呐K移植術(shù)后第6天取出心臟移植物，經(jīng)過固定包埋后，做成病理切片，然后通過HE染色觀察到對(duì)照野生型小鼠的移植心臟中有大量的炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，而且心肌細(xì)胞也大量的被破壞。與此相反的是，Jak2基因缺失小鼠的移植心臟中幾乎看不到炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，而且心肌細(xì)胞完好無損。隨后將移植6天后的心臟組織提取RNA，通過real-time PCR技術(shù)檢測(cè)兩組移植心臟中的炎癥性細(xì)胞因子和趨化因子的差別。我們發(fā)現(xiàn)在對(duì)照野生型組移植心臟中高表

15、達(dá) IFN-γ, TNF-α, IL-2, IL-6, IL-12p40和CCL-2等，而在Jak2基因缺失小鼠移植心臟中上述炎癥因子含量很低，尤其是IFN-γ和 IL-12p40幾乎檢測(cè)不到。
　　之前的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明Jak2激酶會(huì)影響小鼠體內(nèi)輔助性T細(xì)胞亞群的構(gòu)成比，因此接下來我們想比較一下心臟移植術(shù)后的Jak2基因缺失心臟移植受體小鼠和野生型心臟移植受體小鼠體內(nèi)輔助性T細(xì)胞亞群的比例差異。首先取出移植術(shù)后6天各組小鼠的脾臟，通

16、過流式細(xì)胞術(shù)我們發(fā)現(xiàn)在脾臟細(xì)胞中，Jak2基因缺失受體小鼠產(chǎn)IFN-γ的Th1細(xì)胞亞群比例明顯低于野生型受體小鼠，于此相反的是Treg細(xì)胞亞群比例高于野生型受體小鼠。在心臟移植物引流淋巴結(jié)中也得到了相同的結(jié)果。
　　眾所周知，Treg細(xì)胞是一群具有免疫調(diào)節(jié)功能的細(xì)胞，因此我們想探討 Jak2基因缺失是否會(huì)影響到Treg細(xì)胞的功能。首先用Treg細(xì)胞分選試劑盒從Jak2基因缺失和野生型心臟移植受鼠脾臟中分選出CD4+CD25+Tre

17、g細(xì)胞，然后從正常野生型小鼠脾臟中分選出CD4陽(yáng)性效應(yīng)T細(xì)胞。接下來用CFSE標(biāo)記被抗CD3抗體刺激活化的CD4陽(yáng)性效應(yīng)T細(xì)胞，然后將其分別以不同比例與Jak2基因缺失小鼠或野生型小鼠來源的CD4+CD25+Treg細(xì)胞混合培養(yǎng)。發(fā)現(xiàn)Jak2基因敲除的Treg細(xì)胞其免疫抑制能力與WT小鼠來源的Treg細(xì)胞相當(dāng)，這說明Jak2激酶并不影響Treg細(xì)胞的免疫抑制功能。
　　Jak2基因缺失是否會(huì)影響到CD4陽(yáng)性T細(xì)胞的增殖能力呢?為了

18、闡明這個(gè)問題，我們分別從Jak2基因缺失小鼠和野生型小鼠脾臟中分選出CD4陽(yáng)性T細(xì)胞，然后用CFSE標(biāo)記這些細(xì)胞，接下來用抗CD3抗體+抗CD28抗體或PMA+離子霉素刺激這些CD4陽(yáng)性T細(xì)胞。和我們預(yù)想的一樣，經(jīng)過刺激后Jak2基因缺失小鼠和野生型小鼠脾臟來源的CD4陽(yáng)性T細(xì)胞表現(xiàn)出類似的增殖能力，這說明Jak2激酶并不參與CD4陽(yáng)性T細(xì)胞的增殖過程。為了確認(rèn)以上結(jié)果的準(zhǔn)確性，我們用混合淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)實(shí)驗(yàn)來評(píng)估同種異系抗原刺激的增殖過

19、程。首先體外培養(yǎng)準(zhǔn)備BALB/c小鼠骨髓來源的DC細(xì)胞（bone marrow-derived DC），然后用絲裂霉素C處理DC細(xì)胞讓它們不能分裂增殖，接下來用這些DC細(xì)胞在體外培養(yǎng)刺激Jak2基因缺失小鼠或野生型小鼠脾臟來源的CD4陽(yáng)性T細(xì)胞。和之前體外刺激實(shí)驗(yàn)一致，Jak2基因缺失的CD4陽(yáng)性T細(xì)胞經(jīng)過同種異系抗原刺激后其增值能力與野生型小鼠來源的CD4陽(yáng)性T細(xì)胞相當(dāng)。
　　為了探討Jak2基因缺失是通過哪條信號(hào)通路影響Th1

20、細(xì)胞和Treg細(xì)胞之間的動(dòng)態(tài)平衡，我們首先在CD4陽(yáng)性T細(xì)胞中檢測(cè)各種細(xì)胞因子導(dǎo)致的Jak2激酶活性的改變。我們從野生型小鼠脾臟中分選出CD4陽(yáng)性T細(xì)胞，然后分別用IFN-γ, IL-12和IL-2去刺激細(xì)胞，然后用western blot方法檢測(cè)p-Jak2激酶蛋白水平的變化。我們發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過IFN-γ或IL-12刺激后，p-Jak2激酶明顯增多，而IL-2刺激后的CD4陽(yáng)性T細(xì)胞中的p-Jak2激酶幾乎檢測(cè)不到。
　　以上結(jié)果提

21、示我們?nèi)z測(cè)經(jīng)過IFN-γ或IL-12刺激后，Jak2激酶下游到底是哪些信號(hào)分子發(fā)生了改變。我們發(fā)現(xiàn)，在靜息狀態(tài)下，野生型和 Jak2基因缺失小鼠來源的CD4陽(yáng)性T細(xì)胞中p-STAT4幾乎檢測(cè)不到，但是經(jīng)過IL-12刺激后，野生型小鼠來源的CD4陽(yáng)性T細(xì)胞中p-STAT4明顯提高，而Jak2基因缺失小鼠來源的CD4陽(yáng)性T細(xì)胞中p-STAT4依舊檢測(cè)不到。與此類似的是，細(xì)胞因子IFN-γ能誘導(dǎo)野生型來源CD4陽(yáng)性T細(xì)胞高表達(dá)p-STAT1

22、，而雖然經(jīng)過IFN-γ刺激，Jak2基因缺失小鼠來源的CD4陽(yáng)性T細(xì)胞中p-STAT1仍然幾乎檢測(cè)不到。有趣的是，經(jīng)過細(xì)胞因子IL-2刺激后，Jak2基因缺失小鼠和野生型小鼠來源的CD4陽(yáng)性 T細(xì)胞都能誘導(dǎo)高表達(dá)p-STAT5,并且兩組之間差別不大。綜合以上結(jié)果我們得知，Jak2激酶缺失后能夠選擇性的抑制IL-12/STAT4和IFN-γ/STAT1信號(hào)通路，進(jìn)而減弱了na?ve T細(xì)胞定向分化為Th1細(xì)胞的能力。與此相反的是，Jak2

23、激酶對(duì)于IL-2/STAT5信號(hào)通路來說是非必要的，所以Jak2激酶缺失后并不影響到 Treg細(xì)胞的發(fā)育。由于Jak2激酶缺失并不影響IL-2/STAT5信號(hào)通路，那么Jak2基因缺失小鼠體內(nèi)Treg細(xì)胞比例升高的原因可能是由于IL-12和IFN-γ信號(hào)通路受損，導(dǎo)致在體內(nèi)缺失了IFN-γ的環(huán)境中，Jak2基因缺失小鼠來源的na?ve T細(xì)胞更傾向于分化為Treg細(xì)胞。
　　為了弄清楚Jak2基因缺失到底是通過哪些更深層的機(jī)制來影

24、響Th1細(xì)胞亞群的發(fā)育，我們需要檢測(cè)Jak2基因缺失后對(duì)于Th1細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的影響，例如T-bet蛋白（轉(zhuǎn)錄因子T box21）和Hlx(H2.0-like homeobox),其中T-bet作為Th1的主調(diào)控因子參與Th1的分化，而Hlx能夠誘導(dǎo)Th1細(xì)胞分泌IFN-γ，進(jìn)而維持Th1細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)。首先，我們用na?ve T細(xì)胞試劑盒分別從Jak2基因缺失小鼠和野生型小鼠脾臟中分選出na?ve T細(xì)胞，然后將這些細(xì)胞放在Th1細(xì)胞定

25、向分化培養(yǎng)條件下培養(yǎng)，最后用western blotting方法檢測(cè)以上兩個(gè)Th1細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子的蛋白表達(dá)水平。我們發(fā)現(xiàn)來自于野生型小鼠的na?ve T細(xì)胞經(jīng)過定向分化后，細(xì)胞蛋白中T-bet和Hlx蛋白表達(dá)明顯增多。與此相反的是，Jak2基因缺失的na?ve T細(xì)胞經(jīng)過定向分化以后，細(xì)胞中T-bet和Hlx蛋白幾乎檢測(cè)不到。為了進(jìn)一步確認(rèn)以上結(jié)果，我們又檢測(cè)了Runx3（Runt相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子3）的表達(dá)，Runx3主要是和T-bet協(xié)

26、同作用來保證Th1細(xì)胞的分化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，Runx3蛋白表達(dá)和T-bet一樣，在野生型小鼠來源的分化細(xì)胞中表達(dá)明顯增高，而在 Jak2基因缺失小鼠來源的分化細(xì)胞中幾乎檢測(cè)不到。接下來我們又檢測(cè)了T-bet下游的信號(hào)通路，結(jié)果發(fā)現(xiàn)雖然Jak2基因敲除以后抑制了T-bet的表達(dá)，但是這一過程并沒有完全抑制T-bet誘導(dǎo)蛋白之一IL-12Rβ2的表達(dá)。綜合以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們得出一下結(jié)論：Jak2基因缺失主要是通過抑制 Th1細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子T-be

27、t/Hlx以及相關(guān)協(xié)同轉(zhuǎn)錄因子Runx3的表達(dá)，進(jìn)而影響到Th1細(xì)胞的分化。
　　三、結(jié)論
　　綜上所述，Jak2激酶缺失以后導(dǎo)致了Th1細(xì)胞發(fā)育障礙，但是促進(jìn)了有免疫調(diào)節(jié)功能的Treg細(xì)胞的發(fā)育分化，這說明Jak2激酶在Th1/Treg細(xì)胞之間的免疫平衡中起到了非常關(guān)鍵的作用。我們也用小鼠異位心臟移植模型驗(yàn)證了以上結(jié)論，Jak2基因敲除明顯延長(zhǎng)了心臟移植物的存活時(shí)間。我們的細(xì)胞學(xué)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，Jak2激酶缺失與否并不影響 CD

28、4 T細(xì)胞的增殖能力。機(jī)制實(shí)驗(yàn)我們發(fā)現(xiàn) Jak2激酶缺失主要是通過減弱IFN-γ/STAT1和 IL-12/STAT4信號(hào)通路，以及抑制Th1細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子T-bet, Hlx和Runx3的表達(dá)，進(jìn)而阻礙了Th1細(xì)胞分化發(fā)育。與此相反的是，Jak2激酶缺失并不影響IL-2/STAT5信號(hào)通路，由于此信號(hào)通路在Treg細(xì)胞分化發(fā)育中起關(guān)鍵作用，因此 Jak2激酶缺失并不影響 Treg分化，甚至由于缺乏 Th1細(xì)胞的影響而促進(jìn) Treg的