雌激素介導的Wnt-β-catenin信號通路調(diào)控子宮內(nèi)膜異位癥上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的作用機制研究.pdf

1、目的：
　　（1）研究子宮內(nèi)膜異位癥中是否存在上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化現(xiàn)象；
　?。?）研究雌激素在內(nèi)異癥EMT發(fā)生中的作用以及Wnt/β-catenin通路在雌激素促進內(nèi)異癥EMT發(fā)生中的作用；
　?。?）探討雌激素介導Wnt/β-catenin信號通路調(diào)控子宮內(nèi)膜異位癥EMT的分子機制。
　　方法：
　?。?）收集明確診斷內(nèi)異癥患者的在位和異位子宮內(nèi)膜以及單純因輸卵管因素的不孕癥患者子宮內(nèi)膜（對照組），利用免疫組

2、織化學方法檢測EMT分子標志物E-cadherin、N-cadherin和Vimentin以及核轉(zhuǎn)錄因子β-catenin、Snail在內(nèi)異癥在位（EU）和異位子宮內(nèi)膜（EC）以及正常子宮內(nèi)膜（NOR）中定位表達情況；
　?。?）QRT-PCR和Western blotting檢測內(nèi)異癥患者EU和EC以及NOR中EMT分子標志物E-cadherin、N-cadherin和Vimentin以及核轉(zhuǎn)錄因子β-catenin和Snail

3、的表達；
　?。?）分離、培養(yǎng)原代人子宮內(nèi)膜腺上皮細胞（Endometrial epithelial cells，EECs）；以不同濃度（10-6、10-8mol/L）17β-雌二醇作用EECs48h，qRT-PCR和Western blotting檢測上皮細胞EMT標記物E-cadherin，間質(zhì)表型標記物N-cadherin和E-cadherin轉(zhuǎn)錄抑制因子Snail的表達以及去磷酸化β-catenin的表達；光鏡下觀察細胞的

4、形態(tài)變化；檢測EECs體外粘附、侵襲與遷移能力；
　　（4）分離、培養(yǎng)原代人子宮內(nèi)膜腺上皮細胞（Endometrial epithelial cells，EECs），10-6mol/L17β-雌二醇作用 EECs48h，免疫熒光檢測β-catenin的入核情況；Western blotting檢測上皮細胞去磷酸化β-catenin的表達；
　?。?）高分化子宮內(nèi)膜腺癌細胞，即Ishikawa細胞代替EECs。以不同濃度（10

5、-6、10-8 mol/L）17β-雌二醇作用Ishikawa細胞48h，qRT-PCR和Western blotting檢測Ishikawa細胞EMT標記物E-cadherin、N-cadherin和E-cadherin轉(zhuǎn)錄抑制因子Snail以及去磷酸化β-catenin的表達；
　　（6）利用siRNA靶向沉默Ishikawa細胞的β-catenin基因以阻斷Wnt/β-catenin信號通路，以10-6mol/L17β-雌二

6、醇作用48h，Western blotting檢測 EMT標記分子物E-cadherin，間質(zhì)表型標記物N-cadherin以及E-cadherin轉(zhuǎn)錄抑制因子Snail的表達；檢測Ishikawa細胞體外粘附、侵襲與遷移能力；
　?。?）分別構(gòu)建Snail啟動子熒光素酶報告基因載體，在Ishikawa細胞中應用共轉(zhuǎn)染與雙熒光素酶方法（Dual-luciferase Assay）分析β-catenin TCF/LEF對Snail基

7、因靶啟動子區(qū)域轉(zhuǎn)錄活性的影響；染色質(zhì)免疫共沉淀（Chromatin immunoprecipitation）實驗研究β-catenin/TCF/LEF對Snail基因啟動子區(qū)域是否存在直接作用；
　?。?）構(gòu)建子宮內(nèi)膜異位癥NOD-SCID鼠模型，運用β-catenin siRNA阻斷Wnt/β-catenin信號通路，觀察雌激素對小鼠模型異位內(nèi)膜EMT分子標志物E-cadherin、N-cadherin，核轉(zhuǎn)錄因子Snail的表

8、達以及基質(zhì)金屬蛋白酶9（Matrix metalloproteinases9，MMP9）和血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）表達的影響。
　　結(jié)果：
　　（1）內(nèi)異癥患者EC中E-cadherin的表達較EU和NOR明顯降低，而EU和NOR中E-cadherin的表達無顯著差異；EC中N-cadherin、Vimentin的表達較EU和NOR明顯增高，而EU和N

9、OR中N-cadherin、Vimentin的表達無顯著差異；EC中β-catenin和Snail的表達較在EU和NOR明顯增高，而EU和NOR中β-catenin和Snail的表達無顯著差異，β-catenin和Snail的表達存在正相關(guān)性；
　?。?）QRT-PCR和Western blotting結(jié)果顯示內(nèi)異癥患者EC中E-cadherin mRNA和蛋白的表達較EU和NOR明顯降低，而N-cadherin、Vimentin

10、 mRNA和蛋白的表達較EU和NOR明顯增高；EC中β-catenin和Snail mRNA和蛋白的表達較EU和NOR明顯增高；
　?。?）以不同濃度17β-雌二醇（17β-E2）作用人子宮內(nèi)膜腺上皮細胞（EECs）48h；普通光學顯微鏡下觀察，17β-E2作用后，細胞接近紡錘狀，纖維樣的形態(tài)，細胞間連接由緊密變得分散；免疫細胞化學結(jié)果顯示17β-E2作用后，EECs中E-cadherin表達下降；qRT-PCR和Western

11、blotting結(jié)果顯示雌激素體外能明顯促進EECs中N-cadherin、β-catenin和核轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達，抑制E-cadherin的表達；Transwell表明17β-E2增強EECs的侵襲與遷移能力；
　?。?）雌激素能明顯增加EECs中去磷酸化β-catenin的表達；免疫熒光結(jié)果表明雌激素能增加β-catenin的入核；
　　（5）高分化子宮內(nèi)膜腺癌細胞，即Ishikawa細胞代替EECs。以不同濃度

12、（10-6、10-8 mol/L）17β-雌二醇作用Ishikawa細胞48h，qRT-PCR和Western blotting結(jié)果顯示雌激素體外能明顯促進Ishikawa細胞N-cadherin、β-catenin和核轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達，抑制E-cadherin的表達；
　?。?）siRNA靶向沉默Ishikawa細胞β-catenin基因以阻斷Wnt/β-catenin信號通路，10-6 mol/L17β-雌二醇作用48

13、h，Western blotting結(jié)果顯示雌激素不能夠誘導EMT的發(fā)生，即 E-cadherin表達沒有下降，N-cadherin和 Snail的表達沒有上升；Transwell表明Ishikawa細胞的侵襲與遷移能力明顯降低；
　?。?）雙熒光素酶和染色質(zhì)免疫共沉淀檢測結(jié)果顯示β-catenin能與TCF3結(jié)合，作用于Snail啟動子上游，正向調(diào)控Snail基因的表達，而雌激素能增強這一作用；
　?。?）術(shù)后10天，Sc

14、rambled siRNA+E2、β-catenin siRNA+E2和空白組的模型鼠異位病灶發(fā)生率分別為：75％、25%和0；術(shù)后21天，Scrambled siRNA+E2、β-catenin siRNA+E2和空白組的模型鼠異位病灶發(fā)生率分別為：64%、0和0；雌激素能夠增加異位病灶的種植率，而抑制β-catenin的表達后，種植的概率明顯降低；Western blotting結(jié)果顯示：術(shù)后10天，陰性 siRNA組 E-cadh

15、erin的表達低于 siRNA干擾組和種植前組；N-cadherin、β-catenin和核轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達高于siRNA干擾組和種植前組；術(shù)后21天，陰性siRNA組E-cadherin的表達低于種植前組；N-cadherin、β-catenin和核轉(zhuǎn)錄因子Snail的表達明顯高于種植前組；IHC結(jié)果顯示：術(shù)后10天，VEGF和MMP9表達高于 siRNA干擾組和種植前組，而后兩者之間無顯著差異；術(shù)后21天，VEGF和MMP9