雙丹口服液及其主效成分對(duì)糖尿病腎病作用的研究.pdf

1、研究背景及目的：
　　糖尿病腎病（Diabetic nephropathy，DN）[1]是在糖尿?。―iabetes mellitus，DM）發(fā)病進(jìn)程中出現(xiàn)的以蛋白尿、高血壓、水腫及腎功能損傷等臨床癥狀為特征的疾??；DN的發(fā)病是由多因素共同作用的結(jié)果，其中氧自由基是 DN發(fā)病的重要誘因，患DM時(shí)體內(nèi)自由基生成增多造成氧化應(yīng)激損傷，同時(shí)脂質(zhì)過氧化物能夠直接損傷腎小球基底膜并最終導(dǎo)致腎功能障礙，此外血脂代謝紊亂和腎小球血流動(dòng)力學(xué)異常也

2、是DN發(fā)病的主要原因[2]。雙丹口服液（Shuangdan Oral Liquid，SDO）的主要活性成分為來源于丹參的丹參素（Danshensu，DSS）和來源于牡丹皮的丹皮酚（Paeonol，Pae）[3-5]，其中DSS具有清除組織中氧自由基的能力[6]；同時(shí)DSS還能夠降低血液黏度、抑制血小板聚集和改善微循環(huán)[7,8]。而Pae具有降低三酰甘油（triacylglycerol，TG）、總膽固醇（Total cholesterol

3、，T-CHO）和低密度脂蛋白（Low density lipoprotein，LDL）水平的能力[9]，同時(shí)Pae還能夠抑制脂質(zhì)過氧化反應(yīng)和改善血液流變性[10]。由此可見， DN的病理機(jī)制恰好與SDO中主效成分DSS和Pae的藥理作用相一致，那么，S DO及其主效成分對(duì) DN是否有療效，并且其機(jī)制又如何呢？基于該疑問，本課題組首次設(shè)計(jì)和研究了SDO及其主效成分對(duì)DN的作用及其機(jī)制。
　　研究方法：
　　本實(shí)驗(yàn)分別借助SD雄

4、性大鼠建立DN動(dòng)物模型和高濃度葡萄糖環(huán)境下腎小球系膜細(xì)胞建立細(xì)胞模型來評(píng)價(jià)SDO及其主效成分對(duì)DN的作用及其機(jī)制。采用MTT、流式細(xì)胞術(shù)、RT-PCR和Western Blotting等實(shí)驗(yàn)方法，觀察：①SDO對(duì)DN大鼠的作用；②SDO中的主效成分“丹參素+丹皮酚”（DSS+Pae）對(duì)DN大鼠的作用；③SDO對(duì)腎小球系膜細(xì)胞的作用及其機(jī)制；④“丹參素+丹皮酚”（DSS+Pae）對(duì)腎小球系膜細(xì)胞的作用及其機(jī)制。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)果：

5、>　　1、SDO對(duì)DN大鼠的作用
　?。?）SDO明顯改善DN大鼠的腎功能：與 DN大鼠模型組比較，SDO各給藥組顯著降低DN大鼠24 h尿量并降低其血尿素氮（Blood urea nitrogen，BUN）和血肌酐（serum creatinine，SCr）水平（P＜0.01）。
　?。?）SDO顯著改善DN大鼠血脂代謝：與 DN大鼠模型組比較，SDO各給藥組明顯降低DN大鼠血清中T-CHO、TG和LDL-C的含量，升高H

6、DL-C的含量（P＜0.05）。
　?。?）SDO明顯提高 DN大鼠抗氧化應(yīng)激能力：與 DN大鼠模型組比較，S DO各給藥組顯著升高血清中 T-AOC及 T-SOD活力并降低 NO及 MDA的含量（P＜0.05）。
　?。?）SDO顯著改善DN大鼠腎臟病理性損傷：光鏡下腎小球肥大程度和腎小管上皮空泡變性程度都明顯減輕。
　　2、DSS+Pae對(duì)DN大鼠的作用
　?。?）DSS+Pae明顯改善DN大鼠的腎功能：與D

7、N大鼠模型組比較，DSS+Pae各給藥組顯著降低DN大鼠24 h尿量并降低其BUN和SCr水平（P＜0.01）。
　?。?）DSS+Pae顯著改善DN大鼠血脂代謝：與DN大鼠模型組比較，DSS+Pae各給藥組明顯降低DN大鼠血清中T-C HO，TG和LD L-C的含量，升高H DL-C的含量（P＜0.05）。
　?。?）DSS+Pae明顯提高 DN大鼠抗氧化應(yīng)激能力：與 DN大鼠模型組比較， DSS+Pae各給藥組顯著升高血

8、清中T-AOC及T-SOD活力和降低NO及MDA的含量（P＜0.01）。
　　（4）DSS+Pae各給藥組顯著改善DN大鼠腎臟病理性損傷：光鏡下腎小球肥大程度和腎小管上皮空泡變性程度都明顯減輕。
　　3、SDO對(duì)腎小球系膜細(xì)胞的影響
　?。?）SDO顯著降低了MTT實(shí)驗(yàn)中腎小球系膜細(xì)胞的活力。
　?。?）SDO明顯增加了腎小球系膜細(xì)胞G1期的比例。
　?。?）SDO有效降低了腎小球系膜細(xì)胞流式中B3的比例。

9、
　?。?）透射電鏡下觀察到腎小球系膜細(xì)胞的線粒體中出現(xiàn)大量空泡并且細(xì)胞的核仁明顯固縮。
　　4、DSS+Pae對(duì)腎小球系膜細(xì)胞的影響
　?。?）DSS+Pae顯著降低了MTT實(shí)驗(yàn)中腎小球系膜細(xì)胞的活力。
　?。?）DSS+Pae明顯增加了腎小球系膜細(xì)胞G1期的比例。
　?。?）DSS+Pae有效降低了腎小球系膜細(xì)胞流式中B3的比例。
　?。?）DSS+Pae能明顯促進(jìn)腎小球系膜細(xì)胞凋亡：RT-PCR

10、的結(jié)果顯示，與模型組相比，DSS+Pae組能夠顯著上調(diào)Cyt C，BAX，C ASPASE-3和PARP-1的mRNA表達(dá)水平（P＜0.01），同時(shí)明顯下調(diào)了Bcl-2的mRNA表達(dá)水平（P＜0.05）；Western Blotting的結(jié)果顯示，與模型組相比，DSS+Pae組能夠明顯上調(diào) Cyt C，BAX， CASPASE-3和PARP-1等蛋白的表達(dá)水平（P＜0.05），同時(shí)顯著減少了Bcl-2蛋白的表達(dá)水平（P＜0.05）；此外

11、 DSS+Pae組明顯降低了細(xì)胞線粒體膜電位（P＜0.05）。說明了DSS+Pae可能是通過調(diào)控線粒體介導(dǎo)的凋亡途徑促進(jìn)細(xì)胞凋亡來降低腎小球系膜細(xì)胞數(shù)量，發(fā)揮了抗DN的作用。
　　實(shí)驗(yàn)結(jié)論：
　　本課題分別采用體內(nèi)外動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ蛯?shí)施研究，證實(shí)了SDO及其主效成分對(duì)DN具有顯著治療作用，并且創(chuàng)新性地設(shè)計(jì)了DSS和Pae聯(lián)合應(yīng)用于治療 DN的實(shí)驗(yàn)方案，其作用機(jī)制可能與改善血脂代謝、提高抗氧化應(yīng)激能力和線粒體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信