全外顯子組測(cè)序鑒定RP致病基因EYS新突變及PCG候選致病基因功能研究.pdf

1、遺傳疾病是指遺傳物質(zhì)改變而導(dǎo)致的疾病，且能由親代傳遞于后代。人們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)多種眼睛疾病與遺傳相關(guān)如原發(fā)性先天性青光眼（Primary congential glaucoma， PCG；OMIM231300）、視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、視網(wǎng)膜色素變性（retinitis pigmentosa，RP；OMIM226800）、先天性紅綠色盲、高度近視等。其中，PCG和 RP是兩種非常嚴(yán)重的遺傳致盲性疾病。目前，雖然有不少RP和PCG的致病基因及突變位點(diǎn)得

2、到了鑒定，但這些基因及突變并不能完全解釋所有患者的患病，提示仍然有新的致病基因或突變位點(diǎn)存在。
　　定位克隆、功能克隆等方式是發(fā)現(xiàn)這些疾病致病基因的重要手段。但其具有一定局限性，例如某些疾病家系信息難以收集，疾病的生理生化機(jī)制不明等。隨著測(cè)序技術(shù)的不斷發(fā)展，全外顯子組測(cè)序（Whole-exomesequencing，WES）技術(shù)在遺傳疾病研究中的應(yīng)用越來越廣泛。該技術(shù)利用序列捕獲方法將全基因組范圍外顯子區(qū)域的DNA捕獲并富集后進(jìn)行

3、高通量測(cè)序。另外，該技術(shù)還具備靈敏度高，花費(fèi)低，能夠同時(shí)發(fā)現(xiàn)已知致病基因和未知致病基因突變等優(yōu)勢(shì)。
　　本課題組采用WES技術(shù)對(duì)RP和PCG患者進(jìn)行測(cè)序，以期發(fā)現(xiàn)新的致病基因或新的突變位點(diǎn)，并進(jìn)一步利用細(xì)胞生物學(xué)和動(dòng)物模型等初步功能研究來驗(yàn)證新的致病基因的可靠性。結(jié)果顯示，
　　1）在印度 RP人群中，我們發(fā)現(xiàn)了已知致病基因 EYS的新突變。這些突變包括三對(duì)復(fù)合性雜合突變 c.[8422G>A];[7868G>A]、c.[4

4、606C>G];[5038A>G]和 c.[1418G>T];[2971C>T]，7個(gè)純合突變c.[1872G>A]、c.[8455delA]、c.[9059T>C]、c.[8388C>A]、c.[7187G>C]、c.[2259+1G>A]和c.[3024C>A]。
　　2）對(duì)于課題組前期鑒定的PCG新候選基因P-X，我們進(jìn)行了初步的功能學(xué)研究。生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，該基因突變位點(diǎn) c.C58T（p.R20X）和c.A232G

5、（p.I78V）的氨基酸殘基位于蛋白β折疊區(qū)；并且前者可導(dǎo)致截?cái)嗟鞍椎漠a(chǎn)生，后者突變氨基酸殘基位于β-折疊與α-螺旋連接處，而該區(qū)域位于P-X蛋白GTP酶活性區(qū)；在mRNA水平，該基因在人和小鼠視網(wǎng)膜均有表達(dá)，此外在小鼠的視網(wǎng)膜色素上皮、虹膜、睫狀體、視杯、晶狀體和角膜都也有表達(dá)。在蛋白水平上，通過組織免疫熒光實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，該基因在人視網(wǎng)膜感光細(xì)胞及神經(jīng)節(jié)細(xì)胞有較強(qiáng)表達(dá)；在小鼠視網(wǎng)膜、房角，虹膜等部位有較強(qiáng)表達(dá)。生物細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，該蛋

6、白主要表達(dá)于細(xì)胞漿；并且通過構(gòu)建突變型質(zhì)粒，我們成功地驗(yàn)證了突變位點(diǎn)對(duì)蛋白表達(dá)的影響。其中，突變位點(diǎn)c.[58C>T]使得蛋白表達(dá)缺失，而c.[232A>G]突變則出現(xiàn)蛋白在細(xì)胞內(nèi)的分布出現(xiàn)異常。這些結(jié)果與生物信息學(xué)預(yù)測(cè)結(jié)果一致。
　　3）對(duì)于基因P-X體內(nèi)功能的研究，我們?cè)诎唏R魚中，通過顯微注射Morpholino（MO）阻抑P-X蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)斑馬魚眼睛的發(fā)育受到了影響，表現(xiàn)為眼睛變小，神經(jīng)節(jié)細(xì)胞、視桿細(xì)胞、視錐細(xì)胞變少，分布

7、異常。為了檢測(cè)其原因，我們通過Tunel方法標(biāo)記凋亡細(xì)胞，磷酸化組蛋白抗體標(biāo)記增殖細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)阻抑 P-X蛋白表達(dá)的斑馬魚視網(wǎng)膜細(xì)胞增殖異常，而凋亡與正常對(duì)照無差異，提示 P-X可能通過影響視網(wǎng)膜細(xì)胞的增殖而參與了PCG的發(fā)病。然而，其具體機(jī)制有待進(jìn)一步研究。
　　綜上所述，1）我們通過全外顯子測(cè)序技術(shù)，發(fā)現(xiàn)了印度RP患者已知致病基因 EYS的新突變位點(diǎn)包括三對(duì)復(fù)合性雜合突變，7個(gè)純合突變，豐富了RP致病基因突變譜；2）對(duì)前期發(fā)