IgA腎病患者可溶性尿激酶受體水平與FSGS樣病理損傷的臨床和基礎(chǔ)研究.pdf

1、第一部分IgA腎病患者血漿可溶性尿激酶受體水平與局部節(jié)段性腎小球硬化樣病理改變發(fā)生相關(guān)
　　【目的】已有研究報道可溶性尿激酶受體（soluble urokinase receptor, suPAR）與局部節(jié)段性腎小球硬化（focal segmental glomerulosclerosis, FSGS）的病理發(fā)生可能相關(guān)。本研究將分析suPAR是否參與IgA腎病患者的FSGS樣病理改變。
　　【方法】檢測138例IgA腎病患

2、者血漿suPAR水平，然后分析它們的臨床及病理相關(guān)性。
　　【結(jié)果】我們發(fā)現(xiàn)無論是通過單變量分析還是多變量分析 IgA腎病患者血漿 suPAR值均與年齡和腎功能顯著性相關(guān)。通過多變量分析發(fā)現(xiàn)，女性血漿suPAR水平更高，血漿suPAR水平與患者IgA腎病患者24小時尿蛋白水平和血漿超敏C反應(yīng)蛋白之間沒有顯著的相關(guān)性。在我們的IgA腎病患者隊列中，60例患者病理切片中包含F(xiàn)SGS樣病理改變。通過單變量和多變量分析發(fā)現(xiàn)，與不伴FSGS

3、樣病理改變的IgA腎病患者相比，伴FSGS樣病理改變的IgA腎病患者有著顯著升高的血漿suPAR水平。血漿suPAR值也可以成為區(qū)分IgA腎病患者是否伴有FSGS改變的有效因子。最佳的分界值為1806 pg/ml。同樣無論單變量分析還是多變量分析我們都發(fā)現(xiàn)血漿suPAR濃度均與腎小管萎縮/間質(zhì)纖維化程度顯著性相關(guān)。多變量分析中，血漿 suPAR水平與腎小球新月體形成百分比顯著相關(guān)，與腎小球球性硬化百分比和動脈損傷程度無關(guān)。
　　【

4、結(jié)論】該研究的結(jié)果表明IgA腎病患者血漿suPAR水平顯著性相關(guān)于年齡，性別，腎功能，腎小球萎縮/間質(zhì)纖維化程度和新月體形成百分比。在中國IgA腎病患者中，血漿suPAR可能是判斷FSGS樣病理改變是否存在的潛在預(yù)測因子。
　　第二部分尿激酶受體蛋白提高小鼠原代足突細(xì)胞運動能力的研究
　　【目的】根據(jù)我們前期研究循環(huán)suPAR水平與IgA腎病患者FSGS樣病理改變相關(guān)的結(jié)果，繼續(xù)明確uPAR蛋白對足細(xì)胞的影響。
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5、方法】應(yīng)用免疫熒光及流式細(xì)胞學(xué)技術(shù)鑒定所提取小鼠原代足突細(xì)胞的純度。運用劃痕實驗及遷移實驗檢測uPAR蛋白對小鼠原代足細(xì)胞運動能力的影響。并且，運用western blot技術(shù)檢測各實驗組原代足細(xì)胞運動相關(guān)蛋白的表達(dá)。
　　【結(jié)果】所提小鼠原代足細(xì)胞均高表達(dá)足細(xì)胞特異蛋白 Nephrin、Synaptopodin及WT-1，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞純度為98.4％。劃痕實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與正常對照組相比，10μg/ml uPAR重組蛋白顯著

6、性增強小鼠原代足細(xì)胞24小時及48小時內(nèi)的運動能力（P<0.05）。遷移實驗結(jié)果表明，與正常對照組相比，5μg/ml（P<0.05）及10μg/ml（P<0.01）uPAR重組蛋白均顯著性增強小鼠原代足細(xì)胞24小時及48小時內(nèi)的遷移能力。同時，10μg/ml uPAR蛋白可顯著性增加原代足細(xì)胞RhoA、Rac1及Cdc42蛋白水平的表達(dá)，并且可顯著性降低其Nephrin蛋白水平的表達(dá)。
　　【結(jié)論】通過對RhoA、Rac1及Cdc

7、42蛋白水平表達(dá)的調(diào)節(jié)，uPAR蛋白可以促進(jìn)小鼠原代足細(xì)胞運動能力的增強。
　　第三部分尿激酶受體在不同環(huán)境下影響小鼠系膜細(xì)胞增殖能力的研究
　　【目的】腎小球系膜細(xì)胞增生，凋亡及細(xì)胞外基質(zhì)沉積是多種腎臟疾病中常見的病理改變。尿激酶受體是一種多功能胞膜外蛋白，具有促進(jìn)或抑制細(xì)胞增殖的多重作用。本研究將明確尿激酶受體對于腎小球系膜細(xì)胞的具體作用。
　　【方法】運用MTT及Brdu方法分別于正常、高糖或血清饑餓培養(yǎng)條件下分

8、析uPAR重組蛋白對小鼠系膜細(xì)胞增殖能力的影響。應(yīng)用Western blot實驗技術(shù)檢測不同處理組系膜細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的表達(dá)情況，包括AKT、P-AKT、MEK、P-MEK、ERK及P-ERK蛋白的表達(dá)。同樣運用 MTT技術(shù)分析整合素抑制肽 RGD對各組細(xì)胞增殖能力的影響。
　　【結(jié)果】5μg/ml及10μg/ml濃度水平uPAR顯著性降低正常培養(yǎng)小鼠系膜細(xì)胞24小時及48小時內(nèi)的增殖能力。與正常對照組相比，高糖及血清饑餓處理24

9、小時或48小時內(nèi)均導(dǎo)致系膜細(xì)胞增殖能力顯著性降低。uPAR重組蛋白的干預(yù)顯著促進(jìn)高糖環(huán)境下小鼠系膜細(xì)胞增殖能力抑制水平。相反，uPAR重組蛋白的干預(yù)促進(jìn)血清饑餓環(huán)境下小鼠系膜細(xì)胞的增殖水平。10μg/ml濃度的uPAR蛋白作用最為顯著。與此相對應(yīng)，與單純高糖處理組相比，10μg/ml uPAR重組蛋白顯著性降低高糖處理小鼠系膜細(xì)胞P-AKT、MEK、P-MEK及P-ERK蛋白表達(dá)水平。相反，與單純血清饑餓處理組相比，10μg/ml uP

10、AR重組蛋白顯著性提高血清饑餓處理小鼠系膜細(xì)胞P-AKT、MEK、P-MEK及P-ERK蛋白表達(dá)水平。AKT及ERK蛋白表達(dá)水平均沒有發(fā)生顯著性改變。整合素抑制肽RGD可以顯著性降低uPAR重組蛋白對血清饑餓環(huán)境下小鼠系膜細(xì)胞的促增殖能力（P<0.05）。然而，對uPAR重組蛋白促進(jìn)高糖環(huán)境下小鼠系膜細(xì)胞增殖抑制過程，RGD沒有顯著性拮抗作用。
　　【結(jié)論】通過對P-AKT、MEK、P-MEK及P-ERK蛋白表達(dá)的不同調(diào)節(jié)，uPA

11、R對高糖環(huán)境下系膜細(xì)胞具有抑制增殖作用，而對血清饑餓環(huán)境下系膜細(xì)胞具有促進(jìn)增殖作用。uPAR的促進(jìn)血清饑餓培養(yǎng)條件下小鼠系膜細(xì)胞增殖的過程需要整合素蛋白的參與。
　　第四部分 uPAR蛋白與補體系統(tǒng)激活相互作用性研究
　　【目的】前期研究表明補體通路的激活及血漿suPAR水平均與IgA腎病患者FSGS樣病理改變相關(guān)，本研究將觀察補體系統(tǒng)的激活與suPAR的表達(dá)是否相關(guān)。
　　【方法】檢測210例IgA腎病患者血漿suP

12、AR水平，并與患者腎小球系膜區(qū)C3沉積行相關(guān)性分析。逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）技術(shù)檢測小鼠系膜細(xì)胞及原代足細(xì)胞C3aR及C5aR mRNA表達(dá)。運用Western blot技術(shù)分析不同濃度uPAR蛋白對小鼠系膜細(xì)胞及原代足細(xì)胞C3aR及C5aR蛋白表達(dá)的影響，及不同濃度C3a及C5a蛋白對小鼠系膜細(xì)胞及原代足細(xì)胞uPAR蛋白表達(dá)的影響。
　　【結(jié)果】腎小球系膜區(qū)補體C3沉積3+~4+的IgA腎病患者血漿suPAR濃度顯著性

13、高于C3沉積2+IgA腎病患者血漿suPAR水平（P<0.001）及C3沉積0~1+的IgA腎病患者血漿suPAR水平（P<0.0001）。小鼠系膜細(xì)胞及原代足細(xì)胞均有C3aR及C5aR mRAN表達(dá)。與正常對照組相比，uPAR蛋白可以顯著性增加小鼠系膜細(xì)胞及原代足細(xì)胞C3aR及C5aR蛋白的表達(dá)，且呈劑量依賴性。反過來，補體C3a及C5a也可顯著性增加小鼠系膜細(xì)胞及原代足細(xì)胞uPAR蛋白水平的表達(dá)，也呈劑量依賴性。
　　【結(jié)論】