海藻酸鈉復(fù)合工程化軟骨細(xì)胞調(diào)節(jié)Th17-Treg抗兔AIA的機(jī)理.pdf

1、目的：
　　在海藻酸鈉復(fù)合工程化軟骨細(xì)胞對(duì)兔佐劑性關(guān)節(jié)炎的軟骨缺損方面有一定療效并顯示一定抗炎作用的基礎(chǔ)上，通過研究海藻酸鈉支架、工程化軟骨細(xì)胞及海藻酸鈉支架復(fù)合工程化軟骨細(xì)胞各對(duì)兔 AIA的抗炎作用及該組織工程學(xué)方法抗炎作用分子機(jī)制與Th17/Treg細(xì)胞平衡的關(guān)系，為臨床上應(yīng)用組織工程方法治療RA提供理論依據(jù)并為RA的防治提供新的思路。
　　方法：
　?、?0只實(shí)驗(yàn)用新西蘭長(zhǎng)耳白兔隨機(jī)均分為5組（n=8）：正常組，

2、佐劑性關(guān)節(jié)炎模型組，海藻酸鈉支架復(fù)合工程化軟骨細(xì)胞治療組，海藻酸鈉支架治療組，工程化軟骨細(xì)胞治療組。
　?、瞥槿『Ｔ逅徕c支架復(fù)合工程化軟骨細(xì)胞治療組和工程化軟骨細(xì)胞治療組治療組動(dòng)物骨髓，用percoll密度梯度分離法提取出骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞，體外培養(yǎng)純化至 P3代后加入誘導(dǎo)劑使其發(fā)育成為軟骨細(xì)胞。
　?、菍?duì)模型組及治療組兔膝關(guān)節(jié)腔注射完全弗氏佐劑誘導(dǎo)關(guān)節(jié)炎模型，正常組則注射等量生理鹽水作為對(duì)照。
　?、葘⒅苽浜玫暮Ｔ逅徕c

3、支架，等量的工程化軟骨細(xì)胞懸液及海藻酸鈉支架與工程化軟骨細(xì)胞混合物三種治療物回注到相對(duì)分組應(yīng)兔子關(guān)節(jié)腔內(nèi)，治療一個(gè)月。正常組及模型組兔膝關(guān)節(jié)則注入等量生理鹽水。
　?、沙槿?組兔子外周血進(jìn)行ELISA檢測(cè)Th17和Treg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子IL-22、IL-10和TGF-β的表達(dá)，RT-PCR檢測(cè)關(guān)節(jié)滑膜Th17/Treg細(xì)胞相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子RORγtmRNA和Foxp3mRNA表達(dá)水平的變化情況，并對(duì)關(guān)節(jié)滑膜進(jìn)行組織病理學(xué)檢測(cè)。

4、>　　結(jié)果：
　　⑴注射完全弗氏佐劑21天后，正常組膝關(guān)節(jié)未見明顯變化，造模實(shí)驗(yàn)兔的膝關(guān)節(jié)紅腫，提示佐劑性關(guān)節(jié)炎模型制備成功。
　?、谱泽w骨髓經(jīng)充質(zhì)干細(xì)胞原代培養(yǎng)后形狀呈梭形并在培養(yǎng)瓶中增殖后呈渦旋狀分布，誘導(dǎo)培養(yǎng)后，梭形細(xì)胞向多角形或星形轉(zhuǎn)變，阿利新藍(lán)染成藍(lán)色，標(biāo)志工程化軟骨細(xì)胞誘導(dǎo)成功。
　?、顷P(guān)節(jié)滑膜病理學(xué)結(jié)果顯示正常組滑膜未見炎癥反應(yīng)，模型組兔膝關(guān)節(jié)滑膜出現(xiàn)增生，炎細(xì)胞浸潤(rùn)明顯，治療組炎癥反應(yīng)有所減輕，組織工程

5、治療組抗炎作用最為明顯。免疫組化結(jié)果顯示正常組中 IL-17，IL-22的陽性表達(dá)較模型組低（P<0.05），細(xì)胞治療組與支架治療組與模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，但有降低的趨勢(shì)，組織工程治療組下降明顯（P<0.05）；IL-10在正常組兔膝關(guān)節(jié)滑膜的表達(dá)中高于模型組（P<0.05），細(xì)胞治療組與組織工程治療組中的表達(dá)也較模型組高（P<0.05），支架治療組與模型組比較無差異（P>0.05）；與正常組比較，TGF-β1在模型組中表達(dá)較高（P<

6、0.05），細(xì)胞治療組和支架治療組中 TGF-β陽性結(jié)果較模型組有所減少（P<0.05），組織工程治療組與模型組比較則沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）。
　?、菶LISA試劑盒檢測(cè)兔外周血中TGF-β、IL-10、IL-22的表達(dá)水平。結(jié)果顯示正常組中 TGF-β的表達(dá)量遠(yuǎn)高于模型組（P<0.01），組織工程治療組較模型組升高明顯（P<0.05），細(xì)胞治療組及支架治療組有所提升但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P>0.05）；IL-10、IL-22在

7、正常組及各治療組中的表達(dá)水平較模型組比較無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　?、蒖T-PCR檢測(cè)各組兔膝關(guān)節(jié)滑膜中Th17和Treg細(xì)胞關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子Foxp3與RORγt的mRNA的表達(dá)。結(jié)果顯示在正常組中 Foxp3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量較模型組高（P<0.05），細(xì)胞治療組及支架治療組中 Foxp3 mRNA的相對(duì)表達(dá)量有升高的趨勢(shì)（P>0.05），組織工程治療組的相對(duì)表達(dá)量較模型組高（P<0.05），較正常組低。而滑膜中 RO

8、Rγt mRNA的表達(dá)則相反，在模型組、細(xì)胞治療組及支架治療組中相對(duì)表達(dá)量較正常組和組織工程治療組高。
　　結(jié)論：
　　⑴兔外周血中各組IL-10、IL-22的表達(dá)水平變化不太明顯，TGF-β在正常組高表達(dá)，在模型組低表達(dá)，在各治療組均有升高，但只有組織工程治療組提升顯著（P<0.05），提示海藻酸鈉支架復(fù)合工程化軟骨細(xì)胞治療RA可能與TGF-β有關(guān)。
　　⑵兔關(guān)節(jié)滑膜中RT-PCR檢測(cè)Foxp3與RORγt的mRNA