MTB脂蛋白G在HEK293T細(xì)胞中的表達(dá)和IL-23R基因多態(tài)性與肺結(jié)核易感性的研究.pdf

1、第一部分、MTB脂蛋白G在HEK293T細(xì)胞中的表達(dá)
　　目的:結(jié)核病是威脅全球人類公共衛(wèi)生安全的傳染性疾病，結(jié)核分枝桿菌是引起結(jié)核病的病原菌，脂蛋白在結(jié)核分枝桿菌的致病性中起著重要的作用。本研究利用真核表達(dá)載體pcDNA3.1，構(gòu)建含結(jié)核分枝桿菌(MTB)脂蛋白G(LprG)基因的真核表達(dá)載體pcDNA3.1-Hi s-LprG-FLAG，并在HEK293T細(xì)胞中表達(dá)和純化LprG融合蛋白。
　　方法:以MTB標(biāo)準(zhǔn)株H37

2、Rv的基因組DNA為模板，利用聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)法擴(kuò)增出LprG基因。通過DNA重組構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1-His-LprG-FLAG，重組載體經(jīng)過酶切鑒定和測序分析成功后進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK293T細(xì)胞后，應(yīng)用Western blot法檢測His-LprG-FLAG融合蛋白的表達(dá)。達(dá)到一定的蛋白表達(dá)量后，利用Ni-NTA金屬親和層析柱從細(xì)胞上清和細(xì)胞裂解液中純化融合蛋白His-LprG-FLAG，并用SDS

3、-PAGE和Western blot法檢測純化后的蛋白。
　　結(jié)果:
　　1.成功地構(gòu)建了pcDNA3.1-His-LprG-FLAG的真核表達(dá)載體。
　　2.Western blot結(jié)果表明轉(zhuǎn)染質(zhì)粒后，HEK293T細(xì)胞裂解液中檢測目的蛋白，相對分子量（Mr）為27000。
　　3.經(jīng)Ni-NTA金屬親和層析柱純化后得到高純度的融合蛋白His-LprG-FLAG。
　　結(jié)論:成功構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA

4、3.1-His-LprG-FLAG，并在HEK293T細(xì)胞中表達(dá)和純化了His-LprG-FLAG融合蛋白。
　　第二部分、IL-23R基因多態(tài)性與肺結(jié)核易感性的研究
　　目的:白介素23是一種重要的細(xì)胞因子，白介素23受體在許多免疫系統(tǒng)疾病發(fā)揮作用。該研究通過實驗組和對照組，探討華東地區(qū)人群白介素23受體基因rs11805303位點與肺結(jié)核病的遺傳易感性，從而獲得有意義的單倍型。
　　方法:隨機(jī)選取200例上海市肺科

5、醫(yī)院健康體檢者作為對照組，篩選同時期上海市肺科醫(yī)院肺結(jié)核患者211例。聚合酶鏈反應(yīng)-限制性片段長度多態(tài)性(PCR-RFLP)技術(shù)分析白介素23受體基因rs11805303位點單核苷酸多態(tài)性，DNA測序驗證PCR-RFLP的分析結(jié)果。測序結(jié)果與PCR-RFLP結(jié)果符合后，計算基因型和等位基因頻率。計算其哈溫平衡。卡方檢驗分析分析白介素23受體基因rs11805303位點基因型及等位基因頻率在病例組與對照組之間的分布差異。進(jìn)一步，校正性別和

6、年齡混雜因素后，采用Logistic回歸分析，計算OR值和95％CI。從而確定基因型和等位基因?qū)儆谖ｋU因素還是保護(hù)因素。對照組與實驗組白介素23受體血清水平差異采用方差分析。統(tǒng)計分析采用SPSS16.0軟件分析，單倍型分析采用SHEsis在線軟件。
　　結(jié)果:
　　1.計算實驗組和對照組白介素23受體基因rs11805303位點的基因型頻率，結(jié)果符合哈-溫平衡。說明實驗組和對照組具有群體代表性(P＞0.05)。
　　2

7、.白介素23受體基因rs11805303位點有TT、TC、CC三種基因型。三種基因型及其等位基因在實驗組與對照組分布頻率差異無統(tǒng)計學(xué)意義。Logistic回歸分析，經(jīng)過校正年齡、性別因素后，以CC基因型作為參照，CT基因型增加了肺結(jié)核的患病風(fēng)險[odds ratio(OR)=1.966，95％confidence interval(CI)=1.177-3.286，P=0.01];顯性模型、TT基因型和T等位基因未發(fā)現(xiàn)與肺結(jié)核的患病風(fēng)險相

8、關(guān)。
　　3.對性別分層后，在男性人群中，與IL-23R基因rs11805303位點C等位基因比較，IL-23R基因rs11805303位點T等位基因與肺結(jié)核并無相關(guān)性（OR=1.672，95％CI=0.721-2.773，P=0.21）;與IL-23R基因rs11805303位點CC基因型比較，IL-23R基因rs11805303位點CT+TT基因型與肺結(jié)核患病風(fēng)險無關(guān)(odds ratio(OR)=1.948，CI=1.439

9、-3.910，P=0.25);與IL-23R基因rs11805303位點CC基因型比較，IL-23R基因rs11805303位點CT基因型與肺結(jié)核患病風(fēng)險相關(guān)(oddsratio(OR)=1.878,CI=1.296-3.981,P=0.04);與IL-23R基因rs11805303位點CC基因型比較，IL-23R基因rs11805303位點TT基因型與肺結(jié)核患病風(fēng)險無關(guān)(odds ratio(OR)=1.218，CI=0.934-3.

10、679，P=0.07)。而女性人群中與IL-23R基因rs11805303位點C等位基因比較，IL-23R基因rs11805303位點T等位基因與肺結(jié)核并無相關(guān)性(OR=1.944,95％CI=0.019-3.837,P=0.43);與IL-23R基因rs11805303位點CC基因型比較，IL-23R基因rs11805303位點CT+TT基因型與肺結(jié)核患病風(fēng)險無關(guān)(odds ratio(OR)=1.389，CI=1.783-3.481

11、，P=0.69);與IL-23R基因rs11805303位點CC基因型比較，IL-23R基因rs11805303位點CT基因型與肺結(jié)核患病風(fēng)險無關(guān)(oddsratio(OR)=1.610,CI=1.483-3.100,P=0.17);與IL-23R基因rs11805303位點CC基因型比較，IL-23R基因rs11805303位點TT基因型與肺結(jié)核患病風(fēng)險無關(guān)(odds ratio(OR)=1.830，CI=0.591-3.372，P=