黑色素瘤中線形程序性壞死和血管生成擬態(tài)的研究.pdf

1、研究目的：
　　黑色素瘤是具有雙向分化能力的惡性腫瘤。Maniotis等人在研究黑色素瘤時發(fā)現了血管生成擬態(tài)(vasculogenic mimicry，VM)現象。VM是腫瘤特有的血液供應模式，VM由腫瘤細胞和 PAS陽性物質圍成的管腔，內含紅細胞。本課題組在大量的臨床組織標本的觀察中發(fā)現了線性程序性壞死（linearly patterned programmed cell necrosis，LPPCN）這一特殊的細胞死亡模式。L

2、PPCN是腫瘤細胞群體主動發(fā)生的、沒有炎癥細胞浸潤的死亡模式。前期實驗結果證實 LPPCN的存在促進 VM的形成，其消亡而殘留的空間可能為血管生成擬態(tài)和內皮依賴性血管(endothelium dependent vessel，EDV)的形成提供空間結構基礎。本課題收集135例黑色素瘤組織標本，探討黑色素瘤中LPPCN、VM的現象及其形成機制。
　　研究方法：
　　1.收集135例人黑色素瘤組織標本，運用HE染色及、CD34/

3、PAS雙重染色、c-myc的表達情況方法分別檢測黑色素瘤組織中LPPCN和VM的情況，并初步分析其與黑色素瘤患者臨床病理參數、患者生存預后的關系。
　　2.運用MTT增殖實驗， Matrigel三維培養(yǎng)，侵襲、遷移實驗，劃痕實驗，分別檢測c-myc對黑色素瘤細胞增殖能力，管道形成能力，侵襲、遷移能力，傷口愈合能力的影響。運用Western Blot，RT-PCR，熒光素酶報告基因和免疫共沉淀方法等方法檢測c-myc轉染效果及其對S

4、nail，VE-cadherin蛋白表達的影響。
　　3.運用Annexin V-FITC/Propidium Iodid凋亡實驗和流式細胞術，檢測c-myc對黑色素瘤細胞的促凋亡作用。并使用Western Blot，siRNA實驗檢測c-myc對凋亡相關蛋白Bcl2、Bax的影響。
　　4.利用不同濃度Cocl2體外模擬細胞的梯度缺氧。使用RT-PCR和Western Blot檢測各細胞中HIF-1α、Bcl2、Bax基因

5、及蛋白表達變化，并觀察Bcl2/Bax比值的變化。
　　5.運用裸鼠動物模型，再次驗證 c-myc對黑色素瘤的作用。運用 HE染色、Endomucin/PAS雙染檢測移植瘤內c-myc對LPPCN和VM的影響；運用免疫組化方法檢測VM、凋亡相關蛋白的表達情況。
　　6.建立細胞球石蠟包埋方法。鼠源黑色素瘤細胞系 B16F10細胞球培養(yǎng)，石蠟包埋，HE染色，觀察細胞球中程序性壞死現象。B16F10細胞球在C57小鼠體內培養(yǎng)第5

6、天，將移植瘤取出，石蠟包埋。HE染色觀察LPPCN生成情況。
　　7.無血清懸浮培養(yǎng)法富集黑色素瘤腫瘤干細胞，瓊脂糖懸浮培養(yǎng)黑色素瘤細胞，并石蠟包埋切片HE染色觀察兩組的區(qū)別。Agilent表達譜芯片分析兩者基因表達情況，篩選靶基因進行熒光定量PCR驗證。
　　8.流式細胞分離術分離高、低表達靶基因的B16F10細胞，Western Blot方法驗證分離效果，并檢測VM形成相關蛋白E-cadherin、Twist1，VE-c

7、adherin及腫瘤多能干性相關蛋白Sox2、c-myc的表達情況。
　　9.運用Matrigel三維培養(yǎng)，遷移、侵襲實驗，劃痕實驗，檢測靶基因對黑色素瘤細胞管道形成能力，侵襲、遷移能力及傷口愈合能力的影響。Western Blot和熒光定量PCR方法檢測VM形成相關蛋白E-cadherin、Twist1、Vimentin， VE-cadherin和腫瘤多能干性相關蛋白Sox2、c-myc表達情況。
　　10.使用Notch

8、信號通路抑制劑（γ分泌酶抑制劑DAPT），并使用Western Blot和熒光定量PCR方法檢測靶基因Notch4抑制情況及VM形成相關蛋白表達情況。再次上調穩(wěn)定降表達Notch4的黑色素瘤細胞的Twist1表達，Western Blot檢測E-cadherin和VE-cadherin的表達情況。
　　11.收集120例人黑色素瘤病例，免疫組化方法檢測黑色素瘤組織中Notch4蛋白的表達情況，初步分析其與臨床病理參數、VM之間的關

9、系。
　　研究結果：
　　1.135例人黑色素瘤組織中LPPCN陽性者48.15％，VM陽性者45.93%。兩者均與腫瘤的 Breslow厚度、遠處轉移、患者不良預后相關（p<0.05）。人黑色素瘤組織中高表達 c-myc者占總數的48.15%。c-myc高表達與腫瘤的Breslow厚度、淋巴結轉移、遠處轉移及患者不良預后相關（p<0.05）。c-myc高表達與VM、LPPCN成正相關（p<0.05）。
　　2.體外功

10、能實驗結果顯示c-myc高表達增強A375、MUM-2C細胞的增殖，管道形成，侵襲、遷移能力（p<0.05）。c-myc蛋白能夠促進黑色素瘤細胞多向分化：促進間質表型 Vimentin表達，并通過 TGF-β/Snail/E-cadherin信號通路促進黑色素瘤細胞上皮表型丟失；能夠結合 VE-cadherin啟動子并促進其轉錄，進而促進VM的形成。
　　3.急性或重度缺氧時c-myc蛋白通過上調Bax表達，降低Bcl2/Bax比

11、值，進而促進黑色素瘤細胞凋亡。
　　4.動物模型中，下調 c-myc后 MUM-2B黑色素瘤移植瘤生長速度減慢，腫瘤體積減少，腫瘤中LPPCN與VM數量減少（p<0.05），E-cadherin表達上調， VE-cadherin、Bax、HIF-1α表達下降；上調c-myc后MUM-2C黑色素瘤移植瘤腫瘤的生長速度加快，腫瘤體積增加，LPPCN與VM數量增加（p<0.05）， E-cadherin、HIF-1α、Bax表達下降，V

12、E-cadherin、Bcl2表達升高，且 Bax陽性表達呈線狀排列。
　　5. B16細胞球HE染色發(fā)現細胞球呈現三層結構，從內向外依次為壞死或將死細胞層、靜止細胞層、增殖細胞層。在細胞球的壞死或將死細胞層中死亡的呈現核深染、漿濃縮、細胞間連接消失的現象。但無線形或網狀排列的LPPCN。體內培養(yǎng)第5天。HE染色見無血管長入的移植瘤內有LPPCN樣細胞死亡，但無線形或網狀排列的LPPCN。
　　6. Agilent表達譜芯片

13、結果顯示黑色素瘤干細胞高表達高表達 Sox4(NM_009238), Wnt10a(NM_009518), NGFR(NM_033217)等腫瘤干細胞相關基因，藥物抗性基因ABCA8(NM_013851)、ABCA1(NM_013454)以及Notch信號通路相關基因：Notch3(NM_008716)、Notch4(NM_010929)、Dtx4(NM_172442)、JAG2(NM_010588)和Pofut(NM_080463)。

14、熒光定量PCR再次檢測上述基因表達情況。結果顯示上述10中基因的表達趨勢與芯片結果一致，且Notch4和NGFR差異具有統(tǒng)計學意義。
　　7. Western Blot結果顯示流式細胞分選出的 Notch4highB16F10細胞高表達Notch4、Jagg2、Twist1、VE-cadherin、Sox2蛋白，低表達E-cadherin蛋白。
　　8. Notch4降表達降低A375、MUM-2B細胞的管道形成，侵襲、遷移

15、，傷口愈合能力（p<0.05）。Western Blot和熒光定量PCR結果顯示下調Notch4后， VM形成相關蛋白Twist1、Vimentin、VE-cadherin的表達下降，和上皮表型蛋白E-cadherin表達的升高。
　　9.Western Blot結果表明γ分泌酶抑制劑DAPT抑制了Notch4胞內段的解離并下調 Twist1表達，同時上調 E-cadherin蛋白的表達。再次上調穩(wěn)定降表達Notch4的黑色素瘤細

16、胞中Twist1表達后，Western Blot結果顯示E-cadherin表達降低，VE-cadherin的表達升高。
　　10.120例人黑色素瘤組織中免疫組化結果顯示72（60%）例黑色素瘤患者中Notch4高表達。Notch4免疫組化染色定位于黑色素瘤細胞漿。Notch4高表達與患者TNM分期，淋巴結轉移，患者不良預后及VM相關（p<0.05）
　　結論：
　　1.人體黑色素瘤組織中存在VM和LPPCN現象，且

17、c-myc在人體黑色素瘤組織中高表達，三者均與黑色素瘤的侵襲、轉移等惡性生物學行為和不良預后相關。c-myc高表達與LPPCN，VM成正相關。
　　2. c-myc高表達使黑色素瘤細胞上皮表型丟失，間充質表型增強，促進黑色素瘤VM的形成；c-myc高表達促進黑色素瘤細胞LPPCN的發(fā)生，進而促進黑色素瘤VM的形成。
　　3. LPPCN的形成與腫瘤血管密切相關。
　　4. Notch4在黑色素瘤干細胞中高表達。Notc