TRIB1、SLC22A3基因非編碼區(qū)遺傳變異與中國(guó)漢族人群冠心病的關(guān)聯(lián)及機(jī)制研究.pdf

1、本文對(duì)TRIB1、SLC22A3基因非編碼區(qū)遺傳變異與中國(guó)漢族人群冠心病的關(guān)聯(lián)及機(jī)制進(jìn)行了研究。本研究分為兩個(gè)部分：
　　第一部分：TRIB1、SLC22A3基因非編碼區(qū)遺傳變異與中國(guó)漢族人群血脂及冠心病的關(guān)聯(lián)研究。
　　目的：研究TRIB1基因非編碼區(qū)的遺傳變異rs3201475位點(diǎn)和SLC22A3基因非編碼區(qū)的遺傳變異rs539298、rs1810126、rs3088442、rs2076828位點(diǎn)與中國(guó)漢族人群血脂水平、

2、冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及嚴(yán)重程度的關(guān)系。
　　方法：采用病例對(duì)照研究的方法，嚴(yán)格按照提前制定的納入排除標(biāo)準(zhǔn)在醫(yī)院收集重慶地區(qū)漢族人群中冠心病病人及對(duì)照人群的血樣、流行病學(xué)資料和臨床資料。本研究共納入300例冠心病病例和300例對(duì)照。根據(jù)冠心病病人的冠狀動(dòng)脈造影檢查結(jié)果得到其病變部位和病變支數(shù)信息并計(jì)算其Gensini評(píng)分。采用Sequenom mass array系統(tǒng)對(duì)位于TRIB1基因上的單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotid

3、e polymorphism, SNP）rs3201475位點(diǎn)和位于SLC22A3基因上的rs539298、rs1810126、rs3088442、rs2076828位點(diǎn)進(jìn)行基因分型。采用Haploview軟件繪制各SNPs之間的連鎖關(guān)系，采用Phase2.0軟件進(jìn)行各SNPs組合的單倍型分析及單倍型頻率的估計(jì)，采用SPSS20.0統(tǒng)計(jì)軟件完成對(duì)一般資料、Hardy-Weinberg平衡檢驗(yàn)、SNPs與血脂水平、冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)及嚴(yán)重程度

4、的分析。
　　結(jié)果：⑴病例對(duì)照基本情況分析結(jié)果顯示，冠心病病例組具有較高的吸煙率、甘油三酯水平、脂蛋白(a)水平、高血壓病史、糖尿病病史和降脂藥服用史，而高密度脂蛋白膽固醇水平較低，以上差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。⑵SNPs與血脂水平的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示：位于TRIB1基因上的rs3201475位點(diǎn)基因型間血漿總膽固醇水平的差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且該位點(diǎn)的 TT基因型攜帶者的總膽固醇水平較 CC基因型明顯增高（P<0.05）

5、。位于SLC22A3基因上的rs3088442位點(diǎn)基因型間血漿脂蛋白(a)水平在總?cè)巳航M、對(duì)照組和不服降脂藥的病例組中的差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且AA基因型攜帶者的脂蛋白(a)水平較GG基因型攜帶者均明顯降低，此外我們還發(fā)現(xiàn)該位點(diǎn)的 GA+AA基因型攜帶者的脂蛋白(a)水平較GG基因型攜帶者也均明顯降低（P<0.05）。⑶SNPs與冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示：在校正年齡、性別、吸煙和體重指數(shù)等混雜因素前后，SLC22A3基因上 rs

6、3088442位點(diǎn)的基因型在冠心病病例組和對(duì)照組人群中的頻率分布差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，且AA基因型攜帶者的冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)較 GG基因型攜帶者明顯降低（P<0.05）。同時(shí)，我們發(fā)現(xiàn)rs3088442位點(diǎn)的A等位基因較G等位基因能降低CHD發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)（OR=0.78，95％CI:0.64-0.94，P=0.011）。在危險(xiǎn)因素分層分析時(shí)，在男性、年齡≤60歲、體重指數(shù)≥25kg/m2、無(wú)高血壓史、無(wú)糖尿病史等分組中，rs3088442位點(diǎn)的

7、AA基因型攜帶者的冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)較 GG基因型攜帶者均明顯降低（P<0.05）。而SLC22A3基因上的rs539298、rs1810126、rs2076828位點(diǎn)和TRIB1基因上rs3201475位點(diǎn)的基因型及等位基因在冠心病病例組和對(duì)照組人群中的頻率分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（ P＞0.05）。在rs3201475位點(diǎn)的分層分析中，其基因型在冠心病病例組和對(duì)照組人群中的頻率分布差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。⑷SLC22A3基因上

8、rs3088442位點(diǎn)與冠心病嚴(yán)重程度的關(guān)聯(lián)分析結(jié)果顯示：在病變支數(shù)分析中，以對(duì)照組人群為參照，GG基因型攜帶者主要冠狀動(dòng)脈發(fā)生病變的危險(xiǎn)性為 AA基因型攜帶者的1.44倍（P=0.006）。在病變部位分析中，rs3088442位點(diǎn)的G等位基因與冠心病病人的左冠狀動(dòng)脈主干部位病變呈正相關(guān)（ Ptrend=0.046）。此外， rs3088442位點(diǎn)的G等位基因與冠心病病人的Gensini評(píng)分等級(jí)呈正相關(guān)（Ptrend=0.012）。

9、r>　　結(jié)論：①吸煙、高血壓病、糖尿病、甘油三酯和脂蛋白(a)可能是中國(guó)漢族人群冠心病的危險(xiǎn)因素，高密度脂蛋白膽固醇可能是中國(guó)漢族人群冠心病的保護(hù)因素。②在中國(guó)漢族人群中，TRIB1基因rs3201475位點(diǎn)與血漿總膽固醇水平有關(guān)，SLC22A3基因rs3088442位點(diǎn)與血漿脂蛋白(a)水平有關(guān)。③在中國(guó)漢族人群中，SLC22A3基因rs3088442位點(diǎn)與冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，而TRIB1基因上的rs3201475位點(diǎn)以及SLC22A

10、3基因上的rs539298、rs1810126、rs2076828位點(diǎn)與冠心病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)無(wú)關(guān)。④SLC22A3基因上的rs3088442位點(diǎn)與冠心病的嚴(yán)重程度有關(guān)。
　　第二部分：TRIB1、SLC22A3基因非編碼區(qū)遺傳變異位點(diǎn)的冠心病致病機(jī)制研究。
　　目的：分析TRIB1和 SLC22A3基因非編碼區(qū)遺傳變異對(duì)基因的調(diào)控作用；分析SLC22A3和LPA基因的mRNA水平與冠心病發(fā)生發(fā)展的關(guān)系；分析SLC22A3基因非編碼

11、區(qū)遺傳變異rs3088442位點(diǎn)與SLC22A3和LPA基因mRNA水平的關(guān)系。探索TRIB1和SLC22A3基因的非編碼區(qū)遺傳變異在冠心病發(fā)生發(fā)展過(guò)程中的致病機(jī)制。
　　方法：通過(guò)分子克隆技術(shù)分別構(gòu)建含 TRIB1基因5’-UTR和含 SLC22A3基因3’-UTR的分別針對(duì)rs3201475和rs3088442位點(diǎn)的野生型與突變型質(zhì)粒，在兩種細(xì)胞株中利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)rs3201475位點(diǎn)兩種質(zhì)粒的相對(duì)熒光素酶表達(dá)

12、差異，并分別檢測(cè)rs3088442位點(diǎn)的兩種質(zhì)粒與hsa-miR-147a的mimic或miR-Negative Control共轉(zhuǎn)染后的相對(duì)熒光素酶表達(dá)差異。利用系統(tǒng)抽樣的方法隨機(jī)選擇2015年10月份在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科住院患者，采用反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量 PCR方法測(cè)量選定人群的外周血中 SLC22A3和 LPA基因的mRNA水平，并采用Taqman技術(shù)對(duì)選定人群進(jìn)行rs3088442位點(diǎn)的基因分型。分析冠心病組與非冠心病

13、組之間，以及rs3088442位點(diǎn)不同基通過(guò)分子克隆技術(shù)分別構(gòu)建含 TRIB1基因5’-UTR和含 SLC22A3基因3’-UTR的分別針對(duì)rs3201475和rs3088442位點(diǎn)的野生型與突變型質(zhì)粒，在兩種細(xì)胞株中利用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)檢測(cè)rs3201475位點(diǎn)兩種質(zhì)粒的相對(duì)熒光素酶表達(dá)差異，并分別檢測(cè)rs3088442位點(diǎn)的兩種質(zhì)粒與hsa-miR-147a的mimic或miR-Negative Control共轉(zhuǎn)染后的相對(duì)熒

14、光素酶表達(dá)差異。利用系統(tǒng)抽樣的方法隨機(jī)選擇2015年10月份在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院心內(nèi)科住院患者，采用反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量 PCR方法測(cè)量選定人群的外周血中 SLC22A3和 LPA基因的mRNA水平，并采用Taqman技術(shù)對(duì)選定人群進(jìn)行rs3088442位點(diǎn)的基因分型。分析冠心病組與非冠心病組之間，以及rs3088442位點(diǎn)不同基因型攜帶者之間的SLC22A3和LPA基因mRNA水平的差異。采用SPSS20.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

15、>　　結(jié)果：⑴在HepG2和HeLa兩種細(xì)胞株中攜帶rs3201475-C等位基因和攜帶 rs3201475-T等位基因的兩種質(zhì)粒的相對(duì)熒光素酶活性的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.335和P=0.559）。⑵在293T和HeLa兩種細(xì)胞株中我們發(fā)現(xiàn)攜帶rs3088442-G等位基因的質(zhì)粒，在 hsa-miR-147a的虛擬物 mimic組和 hsa-miR-147a的Negative Control組的相對(duì)熒光素酶活性的差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P

16、=0.537和 P=0.144）。而攜帶 rs3088442-A等位基因的質(zhì)粒，其hsa-miR-147a的虛擬物mimic組比hsa-miR-147a的Negative Control組的相對(duì)熒光素酶活性明顯降低（P=2.2×10-4和 P=2.0×10-3）。⑶共隨機(jī)抽取了67例血樣用于反轉(zhuǎn)錄實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析。其中非冠心病組8例，冠心病組59例（包括12例穩(wěn)定型心絞痛、17例不穩(wěn)定型心絞痛、11例心肌梗死和19例未分類的冠心病

17、病人）。同對(duì)照組人群相比，隨著冠心病嚴(yán)重程度遞增，患者外周血中SLC22A3和 LPA基因 mRNA水平均明顯遞增（ Ptrend=0.003和Ptrend=0.012）。⑷通過(guò)對(duì)rs3088442位點(diǎn)基因型進(jìn)行分組，結(jié)果顯示同AA基因型攜帶者相比，GA、GG基因型攜帶者外周血中SLC22A3和LPA基因mRNA水平均明顯遞增（Ptrend=0.012和Ptrend=7.0×10-6）。
　　結(jié)論：①位于TRIB1基因5’-UTR