鐵自噬促Sideroflexin1依賴性線粒體鐵超載介導(dǎo)apelin-13誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大.pdf

1、目的：Apelin是G蛋白偶聯(lián)受體APJ的內(nèi)源性配體，在心血管系統(tǒng)形成及相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展中具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)室前期研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，apelin-13具有誘導(dǎo)心肌細(xì)胞肥大的作用，且自噬途徑參與了apelin-13誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞肥大過(guò)程。鐵自噬(Ferritinophagy)是最新發(fā)現(xiàn)的一種調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鐵代謝的選擇性自噬。過(guò)度激活鐵自噬可能誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)鐵超載從而參與心肌肥厚的發(fā)展。本課題擬研究apelin-13對(duì)鐵自噬及線粒體鐵代謝的影響，并

2、在前期研究的基礎(chǔ)上探討鐵自噬-線粒體鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白Sideroflexin1(SFXN1)依賴性線粒體鐵超載介導(dǎo)apelin-13促心肌細(xì)胞肥大的新機(jī)制，揭示apelin-13/APJ系統(tǒng)誘導(dǎo)心肌肥厚的新的作用機(jī)制，為開(kāi)發(fā)以APJ為靶點(diǎn)的抗心肌肥厚藥物提供新的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1、Western Blot：檢測(cè)大鼠H9c2心肌細(xì)胞NCOA4,FTH1,SFXN1,TRC40,Tom7,Tom70,DMT1,BNP,

3、LC3II/I的表達(dá)；
　　2、分離線粒體并應(yīng)用WB檢測(cè)線粒體蛋白的表達(dá);
　　3、RNA干擾:設(shè)計(jì)RNA干擾鏈分別干擾H9c2心肌細(xì)胞中NCOA4，TRC40，Tom7，SFXN1的表達(dá)；
　　4、普魯士藍(lán)染色法(Prussian blue staining)觀察H9c2心肌細(xì)胞及心肌組織中鐵沉積；
　　5、鈣黃綠素(Calcein–AM)熒光探針檢測(cè)H9c2心肌細(xì)胞中游離鐵的變化；
　　6、流式細(xì)胞術(shù)檢

4、測(cè)H9c2心肌細(xì)胞中線粒體螯合鐵的含量；
　　7、RPA熒光探針觀察H9c2心肌細(xì)胞中線粒體螯合鐵的含量；
　　8、Mito-SOX熒光探針檢測(cè)H9c2細(xì)胞中線粒體ROS的生成；
　　9、免疫熒光觀察NCOA4和LC3B共定位；
　　10、ScepterTM手持細(xì)胞計(jì)數(shù)器測(cè)量H9c2心肌細(xì)胞的直徑和體積；
　　11、BCA試劑盒測(cè)定H9c2心肌細(xì)胞中的蛋白含量；
　　12、免疫組化觀察人尸檢心肌肥厚心

5、臟組織標(biāo)本和雙腎雙夾大鼠腎血管性高血壓模型大鼠心臟組織中apelin,BNP,NCOA4,SFXN1蛋白的表達(dá)；
　　結(jié)果：
　　1、Apelin-13增加H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)游離鐵含量，且進(jìn)一步促進(jìn)鐵負(fù)載劑-枸櫞酸鐵（FAC）誘導(dǎo)的游離鐵的增加；apelin-13誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)鐵沉積，且進(jìn)一步促進(jìn)鐵劑FAC誘導(dǎo)的鐵沉積；
　　2、Apelin-13以劑量(0-1μmol/L)及時(shí)間(0-24h)依賴性抑制H9c

6、2細(xì)胞中鐵自噬底物鐵蛋白(FTH1)的表達(dá)，促進(jìn)鐵自噬貨物受體NCOA4的表達(dá)；APJ拮抗劑F13A(1μmol/L,24h)阻斷apelin-13(0.1μmol/L,24h)對(duì)FTH1和NCOA4的作用；apelin-13促進(jìn)NCOA4與GFP-LC3B融合；自噬體降解抑制劑羥基氯喹（HCQ）阻斷了apelin-13對(duì)FTH1的降解作用，進(jìn)一步促進(jìn)了apelin-13對(duì)NCOA4的表達(dá)；apelin-13進(jìn)一步增強(qiáng)鐵負(fù)載劑-枸櫞酸鐵

7、（FAC）誘導(dǎo)的鐵自噬；
　　3、NCOA4-siRNA抑制apelin-13(0.1μmol/L,48h)誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞內(nèi)游離鐵的增加；
　　4、Apelin-13(0.1μmol/L,48h)促進(jìn)線粒體鐵超載; apelin-13(0.1μmol/L,6h)促進(jìn)線粒體ROS增加；透射電子顯微鏡下觀察到apelin-13(0.1μmol/L,12h)引起H9c2心肌細(xì)胞線粒體腫脹及空泡化；
　　5、Apeli

8、n-13以劑量(0-1μmol/L)和時(shí)間(0-24h)依賴性促進(jìn)H9c2心肌細(xì)胞中線粒體轉(zhuǎn)鐵蛋白SFXN1的表達(dá)；APJ拮抗劑F13A(1μmol/L,24h)阻斷了apelin-13(0.1μmol/L,24h)對(duì)SFXN1的作用；
　　6、NCOA4-siRNA抑制apelin-13誘導(dǎo)的SFXN1的表達(dá)；
　　7、SFXN1-siRNA抑制apelin-13誘導(dǎo)的線粒體鐵超載以及線粒體ROS的生成；
　　8、A

9、pelin-13以劑量(0-1μmol/L)以及時(shí)間(0-24h)依賴性促進(jìn)H9c2心肌細(xì)胞中線粒體外膜轉(zhuǎn)運(yùn)酶Tom7,Tom70的表達(dá)；APJ拮抗劑F13A(1μmol/L,24h)阻斷了apelin-13(0.1μmol/L,24h)對(duì)Tom7,Tom70的誘導(dǎo)作用；Apelin-13促進(jìn)Tom7錨定于線粒體；
　　9、Tom7-siRNA抑制apelin-13誘導(dǎo)的SFXN1的表達(dá)；
　　10、Apelin-13以劑量

10、(0-1μmol/L)和時(shí)間(0-24h)依賴性促進(jìn)H9c2細(xì)胞中尾錨蛋白識(shí)別因子TRC40的表達(dá)；APJ拮抗劑F13A(1μmol/L,24h)阻斷了apelin-13(0.1μmol/L,24h)對(duì)TRC40的作用；
　　11、TRC40-siRNA抑制apelin-13誘導(dǎo)的Tom7,SFXN1的表達(dá)；
　　12、Apelin-13促進(jìn)鐵離子轉(zhuǎn)運(yùn)體-二價(jià)金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)體(DMT1)的表達(dá)，且被APJ拮抗劑F13A抑制；<

11、br>　　13、Apelin-13促進(jìn)H9c2心肌細(xì)胞直徑、體積增大和細(xì)胞內(nèi)蛋白含量增加；apelin-13促進(jìn)心肌肥大因子BNP的表達(dá)，且被F13A抑制；
　　14、NCOA4-siRNA抑制apelin-13誘導(dǎo)的H9c2心肌細(xì)胞直徑、體積增大以及心肌肥大因子BNP表達(dá)；SFXN1-siRNA抑制apelin-13誘導(dǎo)H9c2心肌細(xì)胞直徑、體積增大以及心肌肥大因子BNP表達(dá)；Tom7-siRNA，TRC40-siRNA抑制ap