RELM-β調(diào)節(jié)Ca2+-PI3K-Akt-mTOR信號(hào)通路介導(dǎo)低氧誘導(dǎo)的人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖.pdf

1、【目的】研究低氧條件對(duì)體外培養(yǎng)的原代人肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞（PASMCs）增殖產(chǎn)生的影響，以及不同低氧時(shí)間處理?xiàng)l件下，RELM-β在人PASMCs中的表達(dá)情況，探討 RELM-β對(duì)人 PASMCs增殖的影響，并觀察加入重組 RELM-β后人PASMCs中[Ca2+]i通路PI3K/Akt/mTOR的表達(dá)情況，從而為研究低氧性肺血管重塑（HPSR）提供新的理論依據(jù)。
　　【方法】實(shí)驗(yàn)共分為四個(gè)部分。
　?。?）提取、培養(yǎng)人PASM

2、Cs并采用低氧條件處理：采用組織塊貼壁法來(lái)成功分離人 PASMC，在光鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，用α平滑肌動(dòng)蛋白細(xì)胞（α-SM-actin）進(jìn)行標(biāo)記的細(xì)胞免疫學(xué)法進(jìn)行鑒定。取培養(yǎng)狀態(tài)良好的3-5代細(xì)胞置于37℃，1％O2、5%CO2、94%N2的三氣培養(yǎng)箱中，低氧下暴露不同時(shí)間（3h，6h，12h，24h及48h），并設(shè)置常氧（對(duì)照組）進(jìn)行分組。
　?。?）檢測(cè)低氧對(duì)人PASMCs增殖的影響及低氧條件下人PASMCs中RELM-β表達(dá)情況

3、：取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的3-5代人PASMCs細(xì)胞，經(jīng)無(wú)胎牛血清的DMEM/F12培養(yǎng)基24h使細(xì)胞周期同步化后，分別在常氧或低氧條件下處理3h、6h、12h、24h、48h，用Cell Counting Kit8細(xì)胞增殖試劑盒（CCK-8）檢測(cè)低氧對(duì)細(xì)胞增殖的影響；同樣方法將人PASMCs隨機(jī)分為常氧或低氧組（3h、6h、12h、24h、48h），用實(shí)時(shí)熒光定量核酸擴(kuò)增檢測(cè)（Real Time-PCR）和免疫蛋白印跡（Western blot

4、）兩種方法分別檢測(cè)人PASMCs中RELM-β mRNA和蛋白質(zhì)的表達(dá)情況。
　?。?）檢測(cè)RELM-β與人PASMCs增殖的關(guān)系：用EdU免疫熒光法檢測(cè)加入不同濃度重組蛋白R(shí)ELM-β（A組（0ng/ml）、B組（5 ng/ml）、C組（10 ng/ml）、D組（20 ng/ml）、E組（30ng/m）后對(duì)人PASMCs增殖的影響。
　?。?）加入重組蛋白R(shí)ELM-β，研究人PASMCs中[Ca2+]i通路PI3K/Akt

5、/mTOR的表達(dá)情況：根據(jù)人 PASMC中是否加入鈣離子的內(nèi)、外螯合劑及是否用重組RELM-β20ng/ml處理30min，將其隨機(jī)分為四組：1、空白對(duì)照組；2、只加重組RELM-β20ng/ml處理30min；3、加入EGTA（細(xì)胞外鈣離子螯合劑）處理30min，再加入重組RELM-β20ng/ml處理30min組；4、加入BAPTA（細(xì)胞內(nèi)鈣離子螯合劑）處理30min，再加入重組RELM-β20ng/ml處理30min組，用West

6、ern blot檢測(cè)其下游PI3K/Akt蛋白的表達(dá)；另一方面，在人PASMC中加入PI3K的抑制劑LY294002，用重組RELM-β20ng/ml處理30min后，設(shè)計(jì)分組如下：1、空白對(duì)照組；2、只加重組RELM-β10ng/ml處理30min；3、加入PI3K抑制劑后，再加重組RELM-β10ng/ml處理30min。用Western blot檢測(cè)下游因子Akt的表達(dá)。
　　【結(jié)果】
　　1、提取并鑒定人PASMCs

7、
　　（1）取臨床行肺葉切除術(shù)患者的肺小動(dòng)脈，無(wú)菌條件下分離出肺動(dòng)脈中膜層并將其剪碎，分離出人的PASMCs，采用的是組織貼壁的方法，用DMEM/F12培養(yǎng)基（混有1%青霉素-鏈霉素雙抗及15%胎牛血清）原代培養(yǎng)，10-12d后有少量細(xì)胞從組織塊周圍游離出來(lái)，15-17d后細(xì)胞融合成片，采用差速貼壁法提純細(xì)胞，傳代培養(yǎng)2-3代至平滑肌細(xì)胞的純度達(dá)到90%以上。
　?。?）在顯微鏡下可以見(jiàn)到，細(xì)胞的生長(zhǎng)呈典型的長(zhǎng)梭形放射狀，含

8、有豐富的胞漿，有卵圓形細(xì)胞核位于細(xì)胞中心；15-17天后細(xì)胞融合成片，鋪滿瓶底，束狀排列，平行生長(zhǎng)，呈平滑肌細(xì)胞典型的“峰-谷”狀生長(zhǎng)。在熒光顯微鏡下用α-SM-actin免疫熒光染色后觀察，可見(jiàn)細(xì)胞胞漿明顯著紅色，呈沿肌絲分布的紅色熒光，與細(xì)胞平行為絲狀排列，而DAPI染核使得胞核發(fā)藍(lán)色熒光，綜上所述鑒定提取的細(xì)胞是平滑肌細(xì)胞。
　　2、低氧對(duì)人PASMCs增殖的影響及RELM-β表達(dá)情況
　?。?）CCK-8結(jié)果顯示：P

9、ASMCs的光密度值（OD值）均隨著培養(yǎng)時(shí)間的遞增而逐漸增加，不管是在低氧還是常氧條件下；低氧12h、24h、48h組同常氧各對(duì)應(yīng)組比較，均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；低氧組各組之間OD值相比較可見(jiàn)，低氧12h，24h，48h與低氧3h，6h之間差異都有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），低氧24h達(dá)到頂峰（P＜0.05）。
　?。?）Western blot結(jié)果顯示隨著缺氧時(shí)間的遞增，人PASMC中RELM-β表達(dá)增高，缺氧3h增高開(kāi)

10、始有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），缺氧12h達(dá)到增高最高點(diǎn)（P＜0.05），缺氧24h趨于平臺(tái)期，缺氧48h減少但仍較常氧組和缺氧3h有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　（3）q-PCR結(jié)果顯示RELM-βmRNA隨著缺氧時(shí)間的遞增，在缺氧3h表達(dá)增多，較常氧組有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），缺氧12h達(dá)高峰（P＜0.01），缺氧24h及48h降低，但仍較常氧組增高（P＜0.05）。
　　3、RELM-β對(duì)人PASMCs增殖的影

11、響
　　EdU免疫熒光結(jié)果顯示在人PASMCs中加入不同濃度的重組蛋白R(shí)ELM-β， EdU標(biāo)記的細(xì)胞隨著加入重組蛋白R(shí)ELM-β濃度遞增而增多；不管是各組陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)還是增殖細(xì)胞比率兩項(xiàng)指標(biāo)，D組（20 ng/ml）均明顯增高，與對(duì)照組A組（0ng/ml）比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　4、在人 PASMCs中加入重組 RELM-β，檢測(cè)其誘導(dǎo)的[Ca2+]i增加是否激活PI3K/Akt/mTOR信號(hào)通路
　　

12、（1）加入重組蛋白R(shí)ELM-β后，相比于對(duì)照組，PI3K和Akt的蛋白表達(dá)明顯增高，與對(duì)照組比較，第2組的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而加入鈣離子螯合劑后，相較于對(duì)照組，PI3K和Akt的表達(dá)水平雖然是增高的，但3、4組與第2組比較，PI3K和Akt的表達(dá)降低，并且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　（2）加入 PI3K的抑制劑后，Akt的表達(dá)明顯下降，較對(duì)照組，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。
　　【結(jié)論】