溫敏性表面的制備及其在貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)與收獲中的應(yīng)用.pdf

1、碩士學(xué)位論文溫敏性表面的制備及其在貼壁型細(xì)胞培養(yǎng)與收獲中的應(yīng)用PreparationofThermoresponsiveSurfaceanditsApplicationintheCultivationandHarvestofAnchoragedependentcells學(xué)號：20807139完成日期：20130604大連理工大學(xué)DalianUniversityofTechnology大連理工大學(xué)碩士學(xué)位論文摘要貼壁型細(xì)胞在體外培養(yǎng)擴(kuò)增時(shí)

2、由于傳代的需要會(huì)經(jīng)歷反復(fù)的酶解收獲，但是酶解過程會(huì)對細(xì)胞的膜蛋白造成損傷，致使細(xì)胞功能障礙或功能缺失，影響其應(yīng)用潛能，因此有必要選取更為溫和的細(xì)胞收獲方式。研究表明，相比于酶解法，聚N異丙基丙烯酰胺(Polymisopropylacrylamide)，PNIPAAm)類溫敏材料應(yīng)用于貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)和非酶解收獲的優(yōu)勢在于這種溫敏降溫法收獲的細(xì)胞能更大程度上保護(hù)和保留細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，減少傳統(tǒng)的酶解法消化細(xì)胞給細(xì)胞帶來的損傷。將PNIPAAm

3、類聚合物用于體外培養(yǎng)的貼壁型干細(xì)胞的非酶解收獲有望為組織工程提供高質(zhì)量的種子細(xì)胞。本文通過對玻璃微載體或殼聚糖(Chitosan，cs)進(jìn)行改性，在微載體、CS膜及cS分子鏈上接枝溫敏材料單體N異丙基丙烯酰胺fNisopropylacrylamide，NIPAAm)，制備了新型的溫敏性微載體、溫敏性CS雙層膜及P(CS—gTMSPMgNIPAAm)共聚物膜。首先用含碳碳雙鍵的硅烷偶聯(lián)劑3丙基三甲氧基硅烷甲基丙烯酸f3Trimethoxy

4、silylpropylmethacrylate，TMSPM)對表面含有羥基的玻璃微載體進(jìn)行接枝改性，然后以偶氮二異丁腈(2Azobisisobutyronitrile，AIBN)為引發(fā)劑，將NIPAAm和甲基丙烯酸羥丙酯(Hydroxypropylmethacrylate，HPM)接枝到微載體表面，制備了具有溫敏性的微載體，通過掃描電鏡(ScanningElectronMicroscopy，SEM)及能譜儀(Energydispersi

5、vespectrometer，EDS)證實(shí)了接枝后微載體的表面形貌及元素組成的變化。為了考察所制備的溫敏性微載體是否適合骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells，BMMSCs)的粘附、生長及降溫收獲，將分離純化的第四代BMMSCs接種在微載體上，測定了細(xì)胞在微載體表面的粘附率及生長曲線，用免疫熒光染料對細(xì)胞在微載體表面收獲前后的死活狀況進(jìn)行染色，并對溫敏降溫法收獲的細(xì)胞進(jìn)行了再培養(yǎng)。結(jié)果表明微載體表

6、面接枝PNIPAAm后仍具有良好的細(xì)胞相容性，BMMSCs接種在微載體表面24h后粘附率達(dá)到8773％，在接種第5～6天達(dá)到平臺期，采用溫敏降溫法可以從接枝組微載體表面收獲細(xì)胞，收獲的細(xì)胞重新接種12h后能夠很好地貼壁生長。然后，將溫敏共聚物P(NIPAAmCOHPMCOTMSPM)接枝在CS膜表面，制備了表面具有溫敏性的CS雙層膜，用傅立葉變換衰減全反射紅外光譜(AttenuatedtotalreflectionFouriertran

7、sforminfraredspectroscopy。ATRFTIR)確認(rèn)了膜表面共聚物的存在。通過幾種貼壁型細(xì)胞在膜表面的粘附和降溫脫附情況考察了膜的溫敏特性及不同種類的細(xì)胞對膜表面聚合物接枝密度的選擇性，間接證明了聚合物在CS表面的接枝。最后，用TMSPM對CS進(jìn)行接枝改性，然后以過硫酸鉀(Potassiumpersulfate，PPS)／N，NN’，N’四甲基乙二胺(NN，N’，N’tetramethylethylenediamin