豬淋巴毒素β受體基因的克隆及其在IPEC--J2細(xì)胞中的功能研究.pdf

1、由腸道免疫力低下導(dǎo)致的仔豬在斷奶期死亡給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大損失。腸道免疫系統(tǒng)是由免疫細(xì)胞、免疫球蛋白A(IgA)和腸道微生物組成。已有研究表明TNF家族成員之一，淋巴毒素β受體(Lymphotoxinβ receptor)通過對(duì)機(jī)體IgA的調(diào)控在腸道免疫中起關(guān)鍵作用。研究表明，淋巴毒素β受體基因(LTβR)敲除小鼠體內(nèi)缺少淋巴組織，IgA含量下降，細(xì)菌感染后死亡率增高;相反，LTβR信號(hào)通路激活能發(fā)揮抗細(xì)菌感染的作用，同時(shí)也能改變腸道菌群的

2、組成。基于這些研究結(jié)果，我們推測(cè)該基因在豬的腸道免疫中發(fā)揮著重要作用。本研究克隆了豬的LTβR基因CDS，并進(jìn)行了該基因在不同組織，不同腸段的表達(dá)譜研究。進(jìn)一步，我們檢測(cè)到該基因在第二個(gè)內(nèi)含子中有一個(gè)A-G的突變，并檢測(cè)了其在不同豬種中的基因型頻率。為了檢測(cè)LTβ R在豬空腸上皮細(xì)胞系中的生物學(xué)功能，我們利用CRISPR/Cas9技術(shù)獲得了LTβR敲除的IPEC-J2細(xì)胞系，并對(duì)野生型細(xì)胞系和敲除細(xì)胞系的增殖與凋亡進(jìn)行了比較。
　

3、　本研究的主要發(fā)現(xiàn)和結(jié)論如下:
　　1、分離了豬淋巴毒素β受體(LTβR)基因，其編碼區(qū)序列長(zhǎng)度為1515 bp（預(yù)測(cè)的分子量:45.58kDa;等電點(diǎn):5.78），編碼421個(gè)氨基酸。豬的LTβR編碼序列與小鼠和人的同源性分別是81％和78％。
　　2、利用RT-PCR方法分析了L邛R基因的組織表達(dá)譜，確定其在不同組織中的表達(dá)水平。結(jié)果表明，豬LTβR基因在不同組織中表達(dá)量不同，在肝臟、腎臟、肺、脾及脂肪組織中表達(dá)量較高，

4、肌肉組織如背肌、腿肌和心臟中幾乎不表達(dá)該基因。在空腸中表達(dá)量高于十二指腸。
　　3、用不同濃度的內(nèi)毒素(LPS)和干擾素γ(IFNγ)處理IPEC-J2細(xì)胞14小時(shí)后，用QPCR方法檢測(cè)LTβR的表達(dá)水平，結(jié)果表明，用LPS和IFNγ處理，并不能激活和誘導(dǎo)LTβR的表達(dá)。
　　4、擴(kuò)增出包括外顯子1到外顯子3的基因組序列，并發(fā)現(xiàn)一個(gè)位于第二內(nèi)含子的A-G突變位點(diǎn)，用DdeI-PCR-RFLP的方法研究了其在4個(gè)品種（大白豬，

5、杜洛克豬，長(zhǎng)白豬和民豬）中的基因型頻率。結(jié)果顯示，該基因座的基因型頻率在不同品種中存在較大的差異。
　　5、通過CRISPR/Cas9技術(shù)得到LTβR基因敲除的單克隆IPEC-J2細(xì)胞系。雙等位基因敲除的效率達(dá)到9.38％。
　　6、挑選9株單克隆細(xì)胞株的其中一株，1-10＃，進(jìn)行了RNA水平(RT-PCR)和蛋白水平(Westernblotting)盼檢測(cè)。結(jié)果表明，在mRNA水平和蛋白水平上，該基因都得到了敲除。進(jìn)一步，

6、LTβR基因敲除后，它下游通路的基因(VCAM1和IL22)都下調(diào)表達(dá)。
　　7、我們用CCK方法檢測(cè)了LTβR基因?qū)?xì)胞增殖的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，LTβR基因敲除顯著地降低了IPEC-J2細(xì)胞的增殖能力(P＜0.05)。進(jìn)一步，我們通過流式細(xì)胞檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞周期也受到了影響，顯著多的細(xì)胞被阻滯在S期，而不能完成細(xì)胞周期。
　　8、最后，HoloMonitor M4實(shí)時(shí)顯微鏡監(jiān)測(cè)分析表明，LTβR基因敲除顯著地促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡。