阻斷Kupffer細(xì)胞TIM-4功能對(duì)小鼠肝移植排斥反應(yīng)的影響以及相關(guān)機(jī)制研究.pdf

1、目的：
　　探討阻斷Kupffer細(xì)胞（KCs）TIM-4對(duì)誘導(dǎo)小鼠原位肝移植術(shù)后調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（iTreg）的產(chǎn)生以及相關(guān)機(jī)制的研究。
　　方法：
　　1.小鼠原位肝移植術(shù)后KCs TIM-4的表達(dá)以及阻斷TIM-4對(duì)肝移植急性排斥反應(yīng)的影響
　　采用改良的Kamada“二袖套管”法建立C57BL/6→C3H小鼠原位肝移植急性排斥反應(yīng)模型。在未處理小鼠中，小鼠僅做原位肝移植而未做任何處理（LT組），設(shè)sham為對(duì)

2、照組（僅開腹手術(shù)暴露門靜脈）。免疫組化檢測(cè)LT組和sham組移植術(shù)后1d、2d、3d受體肝組織中KCs的活化情況。分離受體KCs，Western blot和RT-PCR檢測(cè)移植術(shù)后1d、3d、7d KCs TIM-4蛋白以及mRNA表達(dá)情況。
　　在處理小鼠中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物隨機(jī)分為3組：sham組，小鼠開腹手術(shù)暴露門靜脈，并經(jīng)門靜脈注入1mL PBS；control mAb組，于供體冷血TIM-4 mAb組，于供體冷血期經(jīng)門靜脈注入含

3、抗TIM-4抗體（0.35mg/只）的1mL PBS。各組均于術(shù)后3d經(jīng)尾靜脈再次分別注入上述液體。小鼠于移植后7d麻醉下開腹穿刺取腹主動(dòng)脈血0.5mL，然后處死小鼠，取下中葉肝組織，余固定包埋。提取各組肝臟KCs，激光共聚焦檢測(cè)KCs TIM-4阻斷情況；全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組小鼠血清AST、ALT、TBIL；ELISA和Western blot檢測(cè)各組小鼠肝組織勻漿TNF-α、IFN-γ、CCL2、CXCL2表達(dá)水平；TUNEL法

4、檢測(cè)各組肝組織細(xì)胞凋亡情況；Western blot檢測(cè)各組KCs p-P65和p-P38蛋白表達(dá)水平。
　　2.阻斷KCs TIM-4對(duì)初始CD4+T細(xì)胞分化以及IL-4/STAT6信號(hào)通路的影響
　　分離模型LT組KCs，流氏分選出TIM-4+KCs（預(yù)先加或不加0.5mg/L TIM-4 mAb處理）。分離和純化WT C3H小鼠脾臟初始CD4+T細(xì)胞。將上述兩種細(xì)胞按1:1比例進(jìn)行共培養(yǎng)3d。處理分為三組：contro

5、l組，作為對(duì)照組，不予以處理；control mAb組，預(yù)先加入0.5mg/L control mAb處理；TIM-4 mAb組，預(yù)先加入0.5mg/L TIM-4 mAb處理。收集各組T細(xì)胞以及上清液。CFSE法檢測(cè)各組CD4+T細(xì)胞增殖情況；ELISA檢測(cè)各組上清IL-4、IL-6、IL-13表達(dá)水平；流氏細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞的產(chǎn)生情況。
　　分離模型LT組KCs，流氏分選出TIM-4+和TIM-

6、4-KCs，并按1:1比例與初始CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)3d，分為三組：control組，作為對(duì)照組，僅初始CD4+T細(xì)胞單獨(dú)培養(yǎng)；TIM-4+組，TIM-4+KCs與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)組；TIM-4-組，TIM-4-KCs與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)組。Western blot分析T細(xì)胞p-STAT6蛋白表達(dá)情況；上述各組用0.5mg/L TIM-4 mAb+/-處理，Western blot分析T細(xì)胞p-STAT6蛋白表達(dá)情況；在TIM-4

7、+組中，用0.5mg/L TIM-4 mAb+/-和IL-4+/-處理，Western blot分析T細(xì)胞p-STAT6蛋白表達(dá)情況。
　　3.阻斷TIM-4+KCs TIM-4功能誘導(dǎo)的iTreg對(duì)肝移植排斥反應(yīng)以及小鼠生存率的影響
　　分離模型LT組KCs，流氏分選出TIM-4+KCs（預(yù)先用TIM-4 mAb處理）與初始CD4+T細(xì)胞進(jìn)行共培養(yǎng)，3d后獲取CD4+CD25+Foxp3+Treg細(xì)胞，調(diào)整iTreg細(xì)胞濃

8、度1×106個(gè)/mL，將所得細(xì)胞于供體冷血期經(jīng)門靜脈注入iTreg組，sham組以及LT組注入相應(yīng)的PBS作為對(duì)照。部分小鼠于移植后7d麻醉下開腹穿刺取腹主動(dòng)脈血0.5mL，然后處死小鼠，取下中葉肝組織，余固定包埋。全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)各組小鼠血清AST、ALT、TBIL；HE檢測(cè)各組小鼠肝組織病理變化情況；余下各組小鼠作為觀察生存期之用，觀察期以小鼠死亡為終點(diǎn)，并做Log-Rank生存資料分析。
　　結(jié)果：
　　1.（1）

9、小鼠移植術(shù)后肝組織KCs的活化數(shù)隨著時(shí)間變化逐漸增多。術(shù)后1d、3d、7d KCs TIM-4蛋白相對(duì)表達(dá)水平分別為0.31±0.04、0.86±0.05、0.77±0.03，明顯高于sham組的0.11±0.03（P＜0.05），mRNA相對(duì)表達(dá)水平分別1.96±0.07、5.25±0.23、4.02±0.17，顯著高于sham組的0.98±0.03（P＜0.05）。（2）在處理小鼠分組中，激光共聚焦檢測(cè)KCs TIM-4表達(dá)情況發(fā)現(xiàn)

10、，TIM-4 mAb組TIM-4熒光表達(dá)強(qiáng)度明顯低于control mAb組（P＜0.05）。術(shù)后7d，與sham組比較，control mAb組血清肝功AST、ALT、TBIL以及肝組織勻漿炎癥因子TNF-α、IFN-γ、CCL2、CXCL2水平明顯增高（P＜0.05），而TIM-4 mAb組上述指標(biāo)水平明顯低于control mAb組（P＜0.05）。Western blot檢測(cè)肝臟組織炎癥因子蛋白表達(dá)和上述結(jié)果一致。各組肝組織細(xì)胞

11、凋亡指數(shù)（AI），TIM-4 mAb組AI值（11.04±2.28）明顯低于TIM-4 mAb組（29.23±2.56）（P＜0.05）。TIM-4 mAb組p-P65以及p-P38蛋白表達(dá)水平分別為0.82±0.23、0.54±0.10，明顯低于control mAb組的1.39±0.27、1.07±0.23（P＜0.05）。
　　2.（1）KCs與CD4+T細(xì)胞按共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，control、control mAb以及TIM-4

12、 mAb組CD4+T細(xì)胞的增殖率分別為（32.3±1.2）%、（31.1±1.4）%、（16.9±0.5）%。ELISA檢測(cè)各組上清IL-4、IL-6、IL-13分泌水平發(fā)現(xiàn)，阻斷TIM-4+KCs TIM-4可明顯減少上述炎癥因子的分泌（P＜0.05）。流式檢測(cè)各組CD4+CD25+Foxp3+T細(xì)胞產(chǎn)生情況，control組、control mAb組以及TIM-4 mAb組CD25、Foxp3雙陽性細(xì)胞分別為（12.8±0.3）%、

13、（13.3±0.5）%、（28.1±0.4）%，后者明顯高于前兩組（P＜0.05）。（2）TIM-4+組T細(xì)胞p-STAT6相對(duì)蛋白表達(dá)水平（1.75±0.06）明顯高于TIM-4-組（0.60±0.06）（P＜0.05）。然而TIM-4+KCs與CD4+T細(xì)胞共培養(yǎng)時(shí)，加入或未加入TIM-4 mAb的p-STAT6蛋白表達(dá)分別為2.29±0.25、1.30±0.11，兩者比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），此現(xiàn)象在TIM-4-組間比

14、較無統(tǒng)計(jì)學(xué)上的差異（P＞0.05）。另外，向培養(yǎng)液中加入IL-4（0.25mg/L）發(fā)現(xiàn)，阻斷KCs TIM-4的表達(dá)，外源性加入IL-4可明顯增高CD4+T細(xì)胞p-STAT6蛋白的表達(dá)（P＜0.05）。
　　3.（1）LT組肝功指標(biāo)明顯高于sham組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），而iTreg組肝功指標(biāo)明顯好轉(zhuǎn)（P＜0.05）。肝組織病理學(xué)檢查，iTreg組RAI平均得分為3.97±0.67，明顯低于LT組8.47±0.9

15、0（P＜0.05）。（2）iTreg組小鼠平均存活時(shí)間（55.7±5.5）d明顯長于LT組平均存活時(shí)間（14.5±3.7）d（P＜0.05）。
　　結(jié)論:
　　1.小鼠移植術(shù)后，活化的KCs TIM-4的表達(dá)水平逐漸增高。阻斷KCs TIM-4可能通過影響NF-κB以及MAPK通路減少炎癥因子的釋放，改善肝組織排斥反應(yīng)的損傷。
　　2.阻斷KCs TIM-4通過抑制IL-4/STAT6信號(hào)通路促進(jìn)初始CD4+T細(xì)胞向i