周圍神經(jīng)再生修復(fù)早期缺氧的氧供方案的建立及應(yīng)用.pdf

1、長節(jié)段周圍神經(jīng)損傷的治療仍是一個世界性難題。目前，應(yīng)用組織工程神經(jīng)支架結(jié)合細胞修復(fù)神經(jīng)缺損，被認為是替代自體神經(jīng)移植治療和克服自體神經(jīng)移植缺陷的最有效方法。然而，由于神經(jīng)損傷周圍組織血管損傷造成的缺血、缺氧，植入組織工程支架內(nèi)的細胞大量死亡，很大程度限制了細胞的功能，從而影響了其修復(fù)神經(jīng)缺損效能的發(fā)揮。因此，在新生血管長入前，建立一種氧供系統(tǒng)為植入體內(nèi)的細胞供氧有望成為修復(fù)長節(jié)段神經(jīng)缺損的有效方法。本研究以全氟三丁胺為基礎(chǔ)，構(gòu)建了結(jié)合有

2、雪旺細胞的氧供修復(fù)系統(tǒng)，在明確PFTBA對缺氧狀態(tài)下雪旺細胞活性及功能有促進作用的基礎(chǔ)上，我們提出了兩種可用于長節(jié)段神經(jīng)損傷的修復(fù)方案。（1）應(yīng)用 PFTBA纖維蛋白水凝膠保護早期缺氧狀態(tài)下的雪旺細胞，并用其填充于可降解膠原-殼聚糖神經(jīng)導(dǎo)管，構(gòu)建雪旺細胞-PFTBA凝膠修復(fù)系統(tǒng)，修復(fù)大鼠長節(jié)段神經(jīng)缺損，促進其神經(jīng)再生。（2）構(gòu)建基于同軸靜電紡絲技術(shù)的殼-核結(jié)構(gòu)，封裝PFTBA，構(gòu)建具有氧緩釋功能的神經(jīng)修復(fù)系統(tǒng)，橋接神經(jīng)缺損，促進神經(jīng)的再

3、生和功能恢復(fù)。該研究提示：基于PFTBA構(gòu)建的氧供修復(fù)系統(tǒng)極大的豐富了利用“氧”作為神經(jīng)損傷修復(fù)的理論，為神經(jīng)損傷修復(fù)開拓了新的領(lǐng)域。整個研究可分為以下三部分：
　　第一部分、PFTBA纖維蛋白水凝膠氧供系統(tǒng)的構(gòu)建及其對缺氧雪旺細胞的保護性研究
　　背景：雪旺細胞作為一種經(jīng)典的組織工程細胞，已經(jīng)被越來越多的學(xué)者應(yīng)用于周圍神經(jīng)損傷修復(fù)。然而，由于組織損傷后局部血管損傷造成的缺血，使得植入的雪旺細胞因缺氧而活性降低，影響了修復(fù)效

4、果。因此，構(gòu)建一種能為雪旺細胞早期供氧材料，保護其活性就顯得即為重要。
　　目的：構(gòu)建PFTBA纖維蛋白水凝膠氧供系統(tǒng)，研究其對缺氧狀態(tài)下雪旺細胞活性和功能的保護。
　　方法：制備一種富含PFTBA的纖維蛋白水凝膠，使其作用于培養(yǎng)于缺氧環(huán)境中的雪旺細胞，從而觀察檢測其對雪旺細胞活性和功能的影響。首先，我們應(yīng)用血氣分析儀定量檢測制備的PFTBA纖維蛋白水凝膠在培養(yǎng)基中的釋氧能力。其次，我們將培養(yǎng)的雪旺細胞種植在含有這種水凝膠的

5、培養(yǎng)基中，并將其置于正常氧或者缺氧環(huán)境中。再次，我們應(yīng)用流式細胞儀對SCs對缺氧的耐受進行檢測，同時應(yīng)用CCK-8對細胞的增殖分化進行評估。進一步通過SCs的遷徙實驗以及RT-PCR的檢測對細胞功能進行研究。最后，我們應(yīng)用PFTBA纖維蛋白水凝膠作為載體，對雪旺細胞的進行3D細胞培養(yǎng)，并采用活-死細胞染色評估細胞短期活性，采用RT-PCR檢測評估細胞功能。
　　結(jié)果：血氣分析表明：PFTBA凝膠能夠明顯升高其周圍培養(yǎng)基的氧濃度；P

6、FTBA能夠明顯升高缺氧培養(yǎng)的雪旺細胞的CCK-8值，降低其凋亡率；PFTBA可以促進3D培養(yǎng)狀態(tài)下雪旺細胞的活性，上調(diào)細胞NGF、BDNF、GDNF、VEGF、N-cam的mRNA表達水平。
　　結(jié)論：PFTBA纖維蛋白水凝膠氧供系統(tǒng)對缺氧的雪旺細胞的活性和功能具有保護作用。
　　第二部分、PFTBA纖維蛋白水凝膠氧供系統(tǒng)修復(fù)神經(jīng)缺損的有效性研究
　　背景：應(yīng)用組織工程神經(jīng)導(dǎo)管結(jié)合雪旺細胞來修復(fù)周圍神經(jīng)缺損，被認為是

7、替代自體神經(jīng)移植治療和克服自體神經(jīng)移植缺陷的最有效方法。然而，由于組織損傷后局部血管損傷造成的缺血、缺氧，神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)部的低氧環(huán)境很大程度上限制了雪旺細胞的活性，從而影響了其修復(fù)神經(jīng)缺損效能的發(fā)揮。因此，應(yīng)用含有攜氧劑PFTBA的水凝膠作為雪旺細胞的載體，使其與神經(jīng)導(dǎo)管復(fù)合，可能是一種更加有效和方便的解決方案，有望明顯改善支架內(nèi)部早期的缺氧環(huán)境，促進雪旺細胞的存活以及功能的發(fā)揮，從而促進外周受損神經(jīng)的再生和功能恢復(fù)。
　　目的：探討

8、PFTBA對植入體內(nèi)的雪旺細胞活性的保護作用，研究PFTBA纖維蛋白水凝膠氧供系統(tǒng)修復(fù)神經(jīng)缺損的有效性。
　　方法：應(yīng)用PFTBA水凝膠作為雪旺細胞的載體，與膠原-殼聚糖神經(jīng)導(dǎo)管有機結(jié)合，構(gòu)建PFTBA神經(jīng)修復(fù)系統(tǒng)，修復(fù)大鼠15mm坐骨神經(jīng)缺損，通過行為學(xué)分析、神經(jīng)電生理檢測、熒光金逆行示蹤、靶器官及再生神經(jīng)遠端的形態(tài)學(xué)分析（Masson染色、甲苯胺藍染色、免疫熒光染色、透射電鏡等）等方法評價神經(jīng)再生和功能恢復(fù)情況。
　　結(jié)

9、果：應(yīng)用PFTBA水凝膠氧供系統(tǒng)修復(fù)長節(jié)段大鼠坐骨神經(jīng)缺損時，復(fù)合雪旺細胞的PFTBA水凝膠的神經(jīng)支架與不含有PFTBA水凝膠的神經(jīng)導(dǎo)管相比，其雪旺細胞的存活率明顯提升，其促進軸突順利貫穿神經(jīng)支架并支配遠端靶器官。
　　結(jié)論：PFTBA水凝膠可以明顯改善神經(jīng)導(dǎo)管內(nèi)部早期的缺氧環(huán)境，促進雪旺細胞的存活以及功能的發(fā)揮，促進周圍神經(jīng)的再生和功能恢復(fù)。
　　第三部分、基于同軸靜電紡絲技術(shù)的PFTBA緩釋修復(fù)系統(tǒng)的研究
　　背景

10、：周圍神經(jīng)損傷時，損傷的血管可以導(dǎo)致局部缺血、缺氧，而這一狀態(tài)一直會持續(xù)至局部組織再血管化。因此，神經(jīng)組織工程支架中心部位的細胞處于缺氧環(huán)境，嚴重限制著神經(jīng)再生的修復(fù)。鑒于此，尋找可以解決局部供氧的材料有望改善局部再生微環(huán)境，保護植入雪旺細胞活性，從而促進神經(jīng)缺損的修復(fù)效果。
　　目的：探討基于同軸靜電紡絲技術(shù)的PFTBA緩釋修復(fù)系統(tǒng)修復(fù)神經(jīng)缺損的效能。
　　方法：基于同軸靜電紡絲技術(shù)，利用聚已內(nèi)脂和殼聚糖，構(gòu)建一種具有殼-

11、核結(jié)構(gòu)的封裝有PFTBA的靜電紡絲材料，并對其釋氧特性進行評估。將雪旺細胞接種于該材料膜上，應(yīng)用血氣分析，CCK-8以及流式周期檢測，評估缺氧環(huán)境或者正常氧環(huán)境中該殼-核結(jié)構(gòu)對雪旺細胞的影響。其次，我們將最佳參數(shù)的PFTBA殼-核結(jié)構(gòu)與PFTBA水凝膠作為雪旺細胞的載體，構(gòu)建神經(jīng)支架修復(fù)系統(tǒng)，修復(fù)大鼠17mm坐骨神經(jīng)缺損，通過行為學(xué)分析、神經(jīng)電生理檢測、熒光金逆行示蹤、靶器官及再生神經(jīng)遠端的形態(tài)學(xué)分析（HE染色、甲苯胺藍染色、免疫熒光染

12、色、透射電鏡等）等方法評價神經(jīng)再生和功能恢復(fù)情況。
　　結(jié)果：PFTBA殼-核結(jié)構(gòu)能夠形成氧緩釋狀態(tài)，維持周圍培養(yǎng)基一定的氧濃度至144h；該PFTBA殼-核結(jié)構(gòu)紡絲對雪旺細胞無明顯毒性，同時能夠保護缺氧狀態(tài)下雪旺細胞的活性；當(dāng)應(yīng)用該結(jié)構(gòu)結(jié)合PFTBA水凝膠修復(fù)坐骨神經(jīng)缺損時，其促進軸突順利貫穿神經(jīng)支架并支配遠端靶器官。
　　結(jié)論：基于 PFTBA構(gòu)建了結(jié)合有雪旺細胞的殼-核結(jié)構(gòu)神經(jīng)支架修復(fù)系統(tǒng)可顯著加快神經(jīng)再生，促進其功能