HMGA2及l(fā)et-7d miRNA對(duì)糖尿病腎臟病腎小管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)分化及腎臟纖維化的調(diào)控.pdf

1、背景和目的:
　　TGFβ1誘導(dǎo)的腎小管上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)在糖尿病腎臟病(DKD)腎纖維化中起關(guān)鍵作用，HMGA2被報(bào)道通過(guò)多重機(jī)制參與TGFβ1誘導(dǎo)的EMT的發(fā)生過(guò)程。微小RNA(miRNA)作為重要的轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控因子也參與EMT的發(fā)生。既往對(duì)TGFβ1/HMGA2在EMT中的研究多集中于腫瘤或其他器官領(lǐng)域，而在DKD背景下，尤其是在腎小管上皮細(xì)胞EMT及纖維化進(jìn)程中的作用目前并不明確。本研究擬探討HMGA2對(duì)TGFβ1誘

2、導(dǎo)的腎小管上皮細(xì)胞EMT及纖維化過(guò)程的影響和作用，并進(jìn)一步針對(duì)靶基因HMGA2，研究其上游miRNA對(duì)HMGA2的影響及參與DKD腎纖維化的潛在作用機(jī)制。通過(guò)上述研究，將有助于我們據(jù)此針對(duì)有效的信號(hào)通路發(fā)現(xiàn)重要的干預(yù)和治療靶點(diǎn)，從而為DKD腎纖維化的治療提供新的思路。
　　方法:
　　1.建立TGFβ1刺激大鼠腎小管上皮細(xì)胞（NRK-52E）的細(xì)胞模型，利用qRT-PCR及western blot的方法檢測(cè)TGFβ1刺激前后

3、HMGA2及EMT相關(guān)基因的表達(dá)變化。
　　2.利用siRNA轉(zhuǎn)染的方法驗(yàn)證HMGA2在TGFβ1誘導(dǎo)的EMT及腎纖維化中的作用，用qRT-PCR及western blot檢測(cè)siRNA沉默HMGA2基因前后其下游轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)變化。
　　3.通過(guò)生物信息學(xué)方法，針對(duì)靶基因HMGA2篩選有價(jià)值的上游miRNA，用qRT-PCR檢測(cè)TGFβ1誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞前后各miRNA的表達(dá)差異，同時(shí)進(jìn)一步于UUO小鼠模型中探索HM

4、GA2及其上游miRNA的表達(dá)變化。
　　4.通過(guò)過(guò)表達(dá)（轉(zhuǎn)染miRNA mimics）和抑制(轉(zhuǎn)染miRNA inhibitors)的功能實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證篩選出的miRNA對(duì)TGFβ1誘導(dǎo)的EMT和腎纖維化的影響和作用。用qRT-PCR及western blot檢測(cè)HMGA2及EMT相關(guān)因子于miRNA過(guò)表達(dá)及抑制前后的表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.qRT-PCR及western blot結(jié)果表明:給予10ng/mL

5、 TGFβ1刺激NRK-52E細(xì)胞48h后，與Control組比較，TGFβ1(48h)組中HMGA2、α-SMA、vimentin、Col-Ⅰ及FN的表達(dá)均明顯升高，E-Cad的表達(dá)明顯降低。
　　2.qRT-PCR及western blot結(jié)果表明:轉(zhuǎn)染siRNA-HMGA2能明顯抑制TGFβ1誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞中HMGA2及α-SMA、vimentin表達(dá)的上調(diào)以及E-Cad表達(dá)的下調(diào);轉(zhuǎn)染siRNA-HMGA2對(duì)其下

6、游轉(zhuǎn)錄因子Snail，Slug和Twist的表達(dá)無(wú)明顯影響。
　　3.針對(duì)靶基因HMGA2，篩選出有價(jià)值的上游miRNA: miRNA-let-7d、miRNA-98、miRNA-33; qRT-PCR結(jié)果顯示:miRNA-let-7d在TGFβ1誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞及UUO小鼠腎臟中的表達(dá)均明顯降低，而HMGA2的表達(dá)則呈反向升高;TGFβ1的刺激對(duì)miRNA-98及miRNA-33的表達(dá)無(wú)明顯影響。
　　4.qRT-

7、PCR及western blot結(jié)果表明:轉(zhuǎn)染let-7d mimic能明顯抑制TGFβ1誘導(dǎo)的NRK-52E細(xì)胞中HMGA2及α-SMA、Col-Ⅰ、FN表達(dá)的上調(diào)以及E-Cad表達(dá)的下調(diào);轉(zhuǎn)染let-7d inhibitor能明顯增強(qiáng)TGFβ1誘導(dǎo)的HMGA2及Col-Ⅰ、FN表達(dá)的上調(diào)以及E-Cad表達(dá)的下調(diào)。
　　結(jié)論:
　　1.TGFβ1可誘導(dǎo)NRK-52E細(xì)胞中HMGA2的高表達(dá)，并使細(xì)胞發(fā)生EMT及纖維化改變。

8、
　　2.對(duì)HMGA2進(jìn)行基因沉默(siRNA-HMGA2)可逆轉(zhuǎn)TGFβ1誘導(dǎo)的EMT及纖維化改變，它是一個(gè)重要的靶基因。
　　3.miRNA-let-7d為HMGA2重要的上游miRNA，miRNA-let-7d/HMGA2在TGFβ1誘導(dǎo)的EMT及腎纖維化進(jìn)程中可能發(fā)揮作用。
　　4.過(guò)表達(dá)miRNA-let-7d可下調(diào)HMGA2的表達(dá)，進(jìn)而抑制TGFβ1誘導(dǎo)的EMT及腎纖維化改變;抑制miRNA-let-7d可