外泌體中miR-27b對(duì)高血壓性左心室肥厚診斷價(jià)值的研究.pdf

1、【研究背景】
　　高血壓是一種以體循環(huán)動(dòng)脈壓升高為主要特點(diǎn)，由基因遺傳、環(huán)境及多種危險(xiǎn)因素相互作用所導(dǎo)致的全身性疾病，它是最常見的慢性病,也是心血管疾病(Cardiovascular disease,CVD)最主要的危險(xiǎn)因素,作為冠心病、心力衰竭、腦卒中及慢性腎臟病(Chronic kidney disease,CKD)的主要并發(fā)癥,不但致殘、致死率高,且嚴(yán)重消耗醫(yī)療和社會(huì)資源,給家庭和社會(huì)造成沉重負(fù)擔(dān)。高血壓性心臟病是指長(zhǎng)期血壓

2、控制不佳而引起的左心室肥厚和左心室舒張功能減退，進(jìn)而進(jìn)展為心力衰竭的疾病。高血壓性左心室肥厚（Hypertensive left ventricular hypertrophy,HTN-LVH）是高血壓性心臟病的特征性表現(xiàn)之一。左心室肥厚的發(fā)生、發(fā)展常引起心臟傳導(dǎo)系統(tǒng)障礙，甚至引起猝死。因此，及早發(fā)現(xiàn)、及時(shí)診斷治療在高血壓性心臟病患者的預(yù)后中顯得十分重要[1]。臨床上一般使用心臟超聲作為其首要診斷措施，雖然它能基本滿足人們的診療需求，但

3、在正確率和檢出率的限制性上仍然促使人們?nèi)ヌ剿鞲_的診療方法。
　　近年來，研究者發(fā)現(xiàn)血液中微小RNA對(duì)其診斷有重要參考價(jià)值,微小RNA（microRNA,miRNA）是一類內(nèi)源性的非編碼單鏈小RNA,它包含20-25個(gè)核苷酸序列，具有時(shí)間、空間特異性和器官特異性，通一系列核酸酶剪切與加工而產(chǎn)生，隨后組裝進(jìn)RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)合體，通過堿基互補(bǔ)配對(duì)的方式識(shí)別靶mRNA，并根據(jù)互補(bǔ)程度的不同指導(dǎo)沉默復(fù)合體降解靶mRNA或者阻遏靶mRN

4、A的翻譯。有大量動(dòng)物和實(shí)驗(yàn)研究文獻(xiàn)報(bào)道，miRNA的調(diào)控在血液系統(tǒng)、消化系統(tǒng)、腫瘤等眾多領(lǐng)域的研究取得了突破性進(jìn)展，同樣，在心臟發(fā)育、心律失常以及心肌肥厚等病理和生理過程中同樣發(fā)揮著重要的作用。例如，F(xiàn)ish等研究發(fā)現(xiàn)miRNA-166表達(dá)不僅與血管發(fā)育的過程有關(guān)，而且與血管完整性的保持和血管生成息息相關(guān)。Schneider等研究指出在胚胎時(shí)期的心肌細(xì)胞中miR-1分子特異性表達(dá)，而心臟瓣膜和血管的形成則與miR-199有關(guān)。Thum等

5、實(shí)驗(yàn)結(jié)果示，mir-21通過抑制SH1基因激活ERK-MAP信號(hào)通路導(dǎo)致生長(zhǎng)因子的分泌和成纖維細(xì)胞的活化，擴(kuò)大心臟纖維化。同樣在心肌肥厚方面，有報(bào)道指出miRNA-27b可通過作用于靶分子MMP13(金屬基質(zhì)蛋白酶13）使心肌肥厚，同時(shí)上調(diào)心臟組織中膠原分子COLI和COLIII表達(dá)。有也研究發(fā)現(xiàn)miR-27b能直接靶向作用于過氧化物酶體增殖物激活受體--γ（PPARγ）抑制其表達(dá)，導(dǎo)致心肌肥大和心功能障礙等。雖然對(duì)于具體促進(jìn)心肌肥大機(jī)

6、制并沒有達(dá)到共識(shí)，但在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，人為加入miR-27b共培養(yǎng)的心肌細(xì)胞明顯比沒有加入miR-27b培養(yǎng)的心肌細(xì)胞肥大。在探索miRNA與心肌肥厚關(guān)系的同時(shí)，人們對(duì)miRNA的運(yùn)載方式研究也日益深入。大量報(bào)道指出， miRNA的轉(zhuǎn)運(yùn)是以一種特殊的方式進(jìn)行-外泌體（exosome）。exosome是由細(xì)胞分泌的具有脂質(zhì)雙分子層膜結(jié)構(gòu)的直徑約30-100nm的微囊泡，幾乎所有的細(xì)胞都能分泌外泌體,其內(nèi)部攜帶著不同狀態(tài)下細(xì)胞產(chǎn)生的蛋白質(zhì)、

7、mRNA、miRNA和長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRM)等物質(zhì)。研究表明，它們可以介導(dǎo)一定距離細(xì)胞間物質(zhì)交換。這一交換是以細(xì)胞內(nèi)遺傳物質(zhì)mRNA或miRNA（信使RNA或微小RNA）被包裹入外泌體并向細(xì)胞外環(huán)境中釋放為基礎(chǔ)的[2]。外泌體的脂質(zhì)雙分子層結(jié)構(gòu)可以保護(hù)其內(nèi)容物不被循環(huán)中的蛋白酶以及核酸酶降解[3]，比血漿中存在的miRNA更穩(wěn)定。近年來，研究者們對(duì)外泌體的分泌和轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制進(jìn)行了深入探索，以求阻斷其致使心肌肥厚的途徑[2-4]?；?/p>

8、以上發(fā)現(xiàn)，本課題組推測(cè)外泌體中的miR-27b表達(dá)量的升高可能提示存在高血壓左心室肥厚的風(fēng)險(xiǎn)。本實(shí)驗(yàn)在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，收集人類血液標(biāo)本，去探索高血壓患者中外泌體中miR-27b與心肌肥厚之間的關(guān)系。
　　【研究目的】
　　探討外泌體中miR-27b在高血壓患者中表達(dá)水平以及對(duì)診斷HTN-LVH的參考價(jià)值。
　　【研究方法】
　　1．收集標(biāo)本
　　本研究嚴(yán)格按照納入標(biāo)準(zhǔn)和剔除標(biāo)準(zhǔn)，收集2015年4月至201

9、7年1月期間就診于廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院內(nèi)科住院部的患者，一共收集到94例符合本研究的患者，將其分為HTN-LVH組（n=38）和高血壓無肥厚的對(duì)照組（n=56）兩組。入院后收集所有患者的年齡、性別、體重、吸煙、飲酒、收縮壓、舒張壓、空腹血糖、糖化血紅蛋白、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、肌酸激酶、肌酸激酶同工酶、總甘油三酯、總膽固醇、低密度脂蛋白膽固醇、高密度脂蛋白膽固醇、血肌酐、乳酸脫氫酶、B型腦鈉肽、左室內(nèi)徑、右室內(nèi)徑、左心室后壁厚度、

10、室間隔厚度和左室射血分?jǐn)?shù)。并于次日清晨空腹抽取患者的靜脈血，用裝有枸櫞酸鈉抗凝劑的試管裝載。
　　2．保存和提取
　　于采集到病人血液后2小時(shí)內(nèi)離心，去掉紅細(xì)胞、血小板和一些大碎片物質(zhì)，將離心后的血漿置于-80℃冰箱凍存，待最后一起解凍。將每個(gè)樣品分成兩組，一組為200ul血漿檢測(cè)其中總miRNAs，另一組取2000ul后提取外泌體，再測(cè)其miRNAs。
　　3．逆轉(zhuǎn)錄和qRT-PCR
　　將全部樣本一起逆轉(zhuǎn)錄，

11、采用實(shí)時(shí)熒光定量反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Quantificational reverse transcription polymerase chain reaction，qRT-PCR）分別檢測(cè)每個(gè)樣本中miR-27b的相對(duì)表達(dá)量。
　　4．統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　運(yùn)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)所有統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，分別進(jìn)行方差齊性和正態(tài)性檢驗(yàn)，符合方差齊性和正態(tài)齊性分布的計(jì)量資料可用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示結(jié)果，對(duì)于不符合者則可運(yùn)用中

12、位數(shù)表示。 HTN-LVH組和高血壓無肥厚組間miR-27b相對(duì)表達(dá)量差異比較可以運(yùn)用t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)，外泌體所占血漿的比值在兩者間的區(qū)別同樣運(yùn)用t檢驗(yàn)進(jìn)行分析。使用Pearson相關(guān)分析法探究外泌體中miRNA-27b與室壁厚度的關(guān)系。使用受試者工作特征曲線（Receiver operating characteristic curve,ROC曲線）評(píng)估外泌體中miR-27b對(duì)心肌肥厚的診斷價(jià)值。所有分析檢驗(yàn)方法中統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果均以P＜0.05

13、為差異具有意義。
　　【結(jié)果】
　　1.高血壓性左心室肥厚組血漿和外泌體中miR-27b的相對(duì)表達(dá)量較對(duì)照組顯著增高（P＜0.05）。
　　2.在HTN-LVH組，外泌體中miR-27b表達(dá)水平與IVSd和LVPWd呈正相關(guān)（P＜0.05），相關(guān)系數(shù)（r）分別為0.55和0.60。
　　3.外泌體中miRNA-27b表達(dá)量曲線下面積（AUC）為0.96，敏感度為86.7％，特異度為96.7%;血漿中AUC則為0.