腫瘤壞死因子α對人喉鱗狀細胞癌mRNA表達譜的影響及通過抑制TRPP2的表達促進人喉鱗狀細胞增殖的實驗研究.pdf

1、喉癌是一種常見的頭頸部惡性腫瘤，占全身惡性腫瘤的1-5%，雖在全身惡性腫瘤中占據(jù)的位置不高，但在呼吸道及頭頸部惡性腫瘤中的位置較為重要，在呼吸道惡性腫瘤中僅次于肺癌，占第二位，在頭頸腫瘤中占第2-5位。喉癌多發(fā)生于40歲以上年齡人群，其中世界男女發(fā)病率之比大約為10:1，部分地區(qū)男女發(fā)病率差異略小，如我國東北地區(qū)男女發(fā)病率差異則小于世界水平。目前流行病學調(diào)查顯示，吸煙和飲酒是喉癌發(fā)病的高危因素，但具體發(fā)病過程是個復雜的生物學變化，同所有

2、的腫瘤一樣，喉癌的發(fā)病和癌基因活化、抑癌基因失活有關(guān)，同時很多其它因素也可促進喉癌的發(fā)生和發(fā)展，如炎癥狀態(tài)、機體內(nèi)離子通道功能改變等。喉癌的臨床癥狀多表現(xiàn)為聲音嘶啞、呼吸困難甚至吞咽困難等，若合并頸部淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移則表現(xiàn)為頸部包塊。喉癌的病理類型大多數(shù)為鱗狀細胞癌。目前喉癌的治療提倡以手術(shù)治療為主，結(jié)合放化療的綜合治療方法，雖然喉癌的治療經(jīng)歷了百余年的進展，喉癌發(fā)病及治療的基礎(chǔ)研究也在不停的進步，但喉癌患者的五年生存率及術(shù)后生存質(zhì)量并未得到

3、大幅改善。
　　瞬時受體電位通道超家族（transient receptor potential，TRP）是一種非選擇性鈣離子通道，在鈣離子信號轉(zhuǎn)導通路中起重要作用。TRP通道目前一般分為兩大類，第一類包括 TRPA、TRPC、TRPN、TRPV，第二類包括 TRPP和TRPML，他們均具有類似的結(jié)構(gòu)，結(jié)構(gòu)中均有一內(nèi)嵌的發(fā)卡通道結(jié)構(gòu)，TRP通道分布廣泛，主要通過介導的鈣離子內(nèi)流作用參與調(diào)節(jié)機體的機械感覺、痛覺、味覺、肌肉收縮、細胞

4、增生、分化、凋亡等眾多生理病理反應。但各種TRP通道的作用并不完全相同，部分TRP通道亞類可以相互或協(xié)同作用調(diào)節(jié)生命活動。
　　TRPP2通道作為TRP超家族中的一員，又稱之為PKD2(polycystin-2)，目前研究較多和確實的證據(jù)認為TRPP2的突變與多囊腎的發(fā)病密切相關(guān)。TRPP2在多種組織中廣泛表達，如血管內(nèi)皮平滑肌細胞、上皮細胞、心肌細胞、腎上腺和卵巢細胞。目前研究認為TRPP2的亞細胞定位有一定的爭議，認為可表達于

5、細胞質(zhì)膜、高爾基體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和原纖毛中，其中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的定位最為認同。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中，TRPP2作為細胞內(nèi)鈣離子釋放的通道，聯(lián)合三磷酸肌醇受體和雷尼丁受體調(diào)節(jié)胞內(nèi)鈣離子的平衡，參與鈣庫介導的鈣離子內(nèi)流過程（(store-operated calcium entry channels, SOCE），從而發(fā)揮各種生理和病理功能，如參與細胞增殖、凋亡、自吞噬等過程。
　　腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factorɑ，TNF-ɑ）最

6、初是以抗腫瘤因子被發(fā)現(xiàn)，是目前發(fā)現(xiàn)的最強的抗腫瘤因子，腫瘤壞死因α是一種多向性細胞因子，其在炎癥反應、細胞分化、免疫調(diào)節(jié)以及抗感染、抗腫瘤方面有重要作用，但研究也表明腫瘤壞死因子α對腫瘤的作用因條件的不同可產(chǎn)生不同的結(jié)果，雖然是最強的抗腫瘤因子，但在某些情況下也可表現(xiàn)為促進腫瘤發(fā)生發(fā)展。
　　生物信息學是近年來廣泛應用于臨床與基礎(chǔ)研究的一門交叉學科，它結(jié)合了信息學、計算機學、統(tǒng)計學等多種技術(shù)對大量的生物數(shù)據(jù)從分子水平通過序列對比、

7、通路分析、生物聚類、統(tǒng)計分析等進行分析、篩選，發(fā)現(xiàn)疾病的異常信息，可作為進一步證實研究的篩選手段，避免盲目無效性的研究。
　　本研究應用人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞系，通過表達譜測序、生物信息學技術(shù)、蛋白印跡、流式細胞術(shù)、細胞增殖實驗、鈣成像以及siRNA技術(shù)分兩部分闡述了腫瘤壞死因子α對人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞的mRNA表達譜的影響以及腫瘤壞死因子α通過抑制TRPP2的表達及其介導的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上鈣離子釋放來增強人喉鱗狀細胞癌He

8、p-2細胞系的增殖。為進一步闡明TRPP2和腫瘤壞死因子α在人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞增殖中的作用以及相關(guān)機制提供新的依據(jù)，有助于闡明喉癌的發(fā)生發(fā)展過程，并有利于對喉癌開發(fā)新的潛在治療方向，為治療喉癌提供實驗室證據(jù)。
　　1.腫瘤壞死因子α對人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞mRNA表達譜的影響及分析
　　既往研究發(fā)現(xiàn)腫瘤壞死因子α對腫瘤的作用是雙方面的，因為條件的不同可表現(xiàn)為促進或抑制。為探討腫瘤壞死因子α對人喉鱗狀細胞癌He

9、p-2細胞的作用，本研究利用mRNA測序技術(shù)、生物信息學分析技術(shù)，揭示了TRPP2相關(guān)mRNA在腫瘤壞死因子α處理的人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞PKD2基因的mRNA表達水平顯著下降(和對照組相比)，由此推測分析腫瘤壞死因子α可能是通過下調(diào)TRPP2導致人喉鱗狀細胞癌細胞增殖的改變。但結(jié)論需要進一步的實驗研究。
　　2.腫瘤壞死因子α通過抑制TRPP2的表達促進人喉鱗狀細胞癌細胞Hep-2增殖的實驗研究
　　腫瘤壞死因子α和

10、TRPP2都參與機體細胞的多種功能，研究表明，鈣離子通道在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中起重要作用，TRPP2作為鈣離子通道中的一員，我們推測其在喉癌的增殖和發(fā)展中發(fā)揮著重要作用，通過第一部分的研究我們對經(jīng)過腫瘤壞死因子α處理的人喉鱗狀細胞癌細胞Hep-2較對照組未處理的人喉鱗狀細胞癌細胞Hep-2在mRNA表達譜的分析中發(fā)現(xiàn)，TRPP2mRNA表達顯著減少，為進一步驗證TRPP2是否參與腫瘤壞死因子α對人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞的影響過程，我們進

11、行了進一步的機制研究。本研究結(jié)果表明腫瘤壞死因子α通過抑制TRPP2的表達調(diào)節(jié)PERK-eIF2α信號通路以及TRPP2介導的鈣離子通道途徑增強了Hep-2細胞的增殖。主要結(jié)果如下：（1）腫瘤壞死因子α能顯著減少人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞的TRPP2的表達和ATP引發(fā)的鈣離子釋放。（2）siRNA特異敲低TRPP2可顯著抑制ATP引發(fā)的鈣離子釋放、消除腫瘤壞死因子α對ATP引發(fā)的鈣離子釋放減少的效應。（3）人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞

12、經(jīng)過腫瘤壞死因子α處理或特異敲低TRPP2處理未影響IP3R-I表達水平和細胞內(nèi)基礎(chǔ)鈣離子濃度。但腫瘤壞死因子α處理和特異性敲除TRPP2對抑制TRPP2的表達有增強效應。（4）腫瘤壞死因子α處理增強了人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞的增殖及G2/M期的比例，但是減少了G0/G1的比例。而siRNA特異敲低TRPP2后，人喉鱗狀細胞癌Hep-2細胞增殖也增加，其表現(xiàn)為S期和G2/M期比例增加，但G0/G1期細胞比例減少。（5）腫瘤壞死因子α