FOXP3對結(jié)腸癌干細(xì)胞自我更新的影響及其機制研究.pdf

1、背景：結(jié)腸癌是發(fā)病率較高的癌癥之一，經(jīng)傳統(tǒng)治療后經(jīng)常發(fā)生復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移，雖然其具體的機制至今仍未完全闡明，但是腫瘤內(nèi)少數(shù)具有自我更新、無限分化以及化療抵抗的腫瘤干細(xì)胞（CSCs）的存在被認(rèn)為在腫瘤復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移過程中起著主要的作用。近年來，用CSCs理論來解釋腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移受到了科學(xué)家們的廣泛認(rèn)可，因此，清除CSCs在腫瘤的治療過程中十分重要。
　　環(huán)氧合酶-2（COX2）是環(huán)氧合酶（COX）同工酶中的一種，它是花生四烯酸向前列腺素（包

2、含前列腺素E2，PGE2）代謝轉(zhuǎn)化所必需的酶。研究發(fā)現(xiàn)，COX2和PGE2在促進(jìn)干細(xì)胞自我更新過程中發(fā)揮了很重要的作用。近年來也有研究發(fā)現(xiàn)：COX2在結(jié)腸癌以及其它種類CSCs中表達(dá)上調(diào)； COX2特異性抑制劑可以降低結(jié)腸癌干細(xì)胞樣球體（Colonosphere）的形成效率（Sphere formation efficiency）。但是COX2在結(jié)腸癌干細(xì)胞（CCSCs）中異常表達(dá)的機制還不是很明了。因此，尋找能夠抑制COX2的分子在C

3、CSCs的研究中十分重要。
　　FOXP3（Forkhead box protein3）是Forkhead轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Tregs)標(biāo)志性分子，通過調(diào)節(jié)Tregs細(xì)胞功能發(fā)揮免疫抑制作用。近年來的研究表明，F(xiàn)OXP3也高表達(dá)于結(jié)腸癌以及其它腫瘤細(xì)胞中。在乳腺癌、卵巢癌以及其它癌癥中發(fā)揮抑癌作用。課題組在胃癌的研究中證明，F(xiàn)OXP3可以通過與NF-κB的相互作用抑制其活性，進(jìn)而抑制COX2的表達(dá)水平，從而發(fā)揮

4、對腫瘤的抑制功能。這提示FOXP3是一個具有抑癌作用的基因，能夠通過與NF-κB相互作用抑制腫瘤。但是FOXP3在CSCs形成和自我更新中的作用尚不清楚。
　　目的：本研究主要深入研討FOXP3對CCSCs自我更新的影響及其具體的分子機制。
　　方法：
　　1.通過幾種不同的人結(jié)腸癌細(xì)胞系在特定培養(yǎng)基中富集培養(yǎng) Colonosphere；通過Real-Time PCR和Western Blot實驗分析結(jié)腸癌細(xì)胞和Col

5、onosphere中FOXP3和COX2的表達(dá)差異以及其相關(guān)性。
　　2.通過感染腺病毒的方法過表達(dá)/干涉結(jié)腸癌細(xì)胞 HT29中 FOXP3的表達(dá)量，然后培養(yǎng)Colonosphere；通過顯微鏡觀察分析過表達(dá)/干涉FOXP3對Colonosphere形成效率的影響；通過側(cè)群細(xì)胞(Side population cells, SP)實驗分析過表達(dá)/干涉FOXP3對SP細(xì)胞比例的影響；通過Real-Time PCR分析過表達(dá)/干涉FO

6、XP3對CCSCs表面標(biāo)志物的影響；通過小鼠移植瘤實驗分析過表達(dá)/干涉FOXP3對CCSCs在小鼠體內(nèi)成瘤能力的影響。
　　3.通過免疫共沉淀（Co-IP）實驗分析FOXP3和NFκB亞基p65蛋白相互作用；通過Real-Time PCR和Western Blot分析過表達(dá)/干涉FOXP3對COX2基因和蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響以及同時干涉 FOXP3和 p65對 COX2基因和蛋白質(zhì)表達(dá)水平的影響；通過Luciferase報告基因分

7、析過表達(dá)FOXP3對COX2啟動子活性的影響以及過表達(dá)FOXP3的同時利用TNFα誘導(dǎo)p65入核對COX2啟動子的影響；染色質(zhì)免疫沉淀分析（CHIP）實驗檢測FOXP3是否與COX2啟動子中的p65位點結(jié)合。
　　4.通過感染腺病毒的方法培養(yǎng)干涉 FOXP3、干涉 COX2以及同時干涉 FOXP3和 COX2的結(jié)腸癌細(xì)胞 HT29，然后培養(yǎng) Colonosphere；通過顯微鏡觀察分析干涉COX2對由低表達(dá)FOXP3引起的Colo

8、nosphere形成效率增強的影響；通過SP實驗分析干涉COX2對由低表達(dá)FOXP3引起的SP細(xì)胞比例增高的影響；通過Real-Time PCR分析干涉COX2對由低表達(dá)FOXP3引起的CCSCs表面標(biāo)志物表達(dá)水平升高的影響；通過小鼠移植瘤實驗分析干涉COX2對由低表達(dá)FOXP3引起的CCSCs在小鼠體內(nèi)成瘤能力增強的影響。
　　結(jié)果：
　　1.在幾種結(jié)腸癌細(xì)胞系中成功富集得到了經(jīng)典的神經(jīng)樣球體 Colonosphere，通

9、過 Real-Time PCR以及流式細(xì)胞術(shù)分析發(fā)現(xiàn)，與結(jié)腸癌細(xì)胞相比，Colonosphere中CCSCs表面標(biāo)志物表達(dá)水平顯著升高，能夠?qū)⑵湟暈?CCSCs來開展后面的實驗。Real-Time PCR和 Western Blot檢測發(fā)現(xiàn)：與對應(yīng)的人結(jié)腸癌細(xì)胞相比，F(xiàn)OXP3在CCSCs中的表達(dá)水平有明顯的降低；而作為FOXP3下游靶基因的COX2，隨著FOXP3在CCSCs中表達(dá)量的降低，其表達(dá)量有顯著升高。在CCSCs中，兩者的表

10、達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。
　　2.通過在顯微鏡下觀察分析過表達(dá)/干涉FOXP3的HT29培養(yǎng)的Colonosphere，結(jié)果表明，過表達(dá)FOXP3可以降低Colonosphere的形成效率；SP實驗結(jié)果表明，過表達(dá) FOXP3可以降低 SP細(xì)胞的比例；Real-Time PCR檢測結(jié)果表明，過表達(dá)FOXP3可以降低CCSCs多種表面標(biāo)志物的表達(dá)水平；小鼠移植瘤實驗結(jié)果顯示，過表達(dá)FOXP3可以降低CCSCs在小鼠體內(nèi)形成腫瘤的能力。相反，

11、干涉FOXP3可以增強Colonosphere的形成效率；增高SP細(xì)胞的比例；增高CCSCs表面標(biāo)志物的表達(dá)水平；增強CCSCs在小鼠體內(nèi)形成腫瘤的能力。
　　3.免疫共沉淀實驗結(jié)果表明，CCSCs中存在著FOXP3與p65蛋白相互作用；Real-Time PCR和 Western Blot實驗結(jié)果表明，過表達(dá) FOXP3可以降低 CCSCs中COX2的mRNA和蛋白表達(dá)水平；相反，干涉FOXP3可以升高CCSCs中COX2的mR

12、NA以及蛋白質(zhì)的表達(dá)水平；而在干涉FOXP3的同時干涉p65，由低表達(dá)FOXP3引起的COX2 mRNA以及蛋白質(zhì)的表達(dá)量升高的作用會受到拮抗；Luciferase報告基因結(jié)果顯示，過表達(dá)FOXP3可以降低COX2啟動子的活性，而由TNFα誘導(dǎo)的p65入核可以拮抗由高表達(dá) FOXP3引起的 COX2基因啟動子活性受到抑制的作用；CHIP實驗結(jié)果顯示，F(xiàn)OXP3可以和COX2基因啟動子上的p65位點相互結(jié)合。
　　4.通過在顯微鏡下

13、觀察分析干涉FOXP3以及同時干涉FOXP3和COX2的HT29培養(yǎng)的Colonosphere，結(jié)果表明，干涉FOXP3可以增強Colonosphere的形成效率；SP實驗結(jié)果表明，干涉FOXP3可以增加SP細(xì)胞的比例；Real-Time PCR檢測結(jié)果顯示，干涉FOXP3可以增強CCSCs表面標(biāo)志物的表達(dá)水平；小鼠移植瘤實驗結(jié)果表明，干涉FOXP3可以增強CCSCs在小鼠體內(nèi)的形成腫瘤的能力。而在干涉FOXP3的同時干涉 COX2，由

14、低表達(dá) FOXP3引起的這些 CCSCs自我更新能力增強的作用會受到抑制。
　　結(jié)論：在 CCSCs中，F(xiàn)OXP3表達(dá)下調(diào)，而 COX2表達(dá)上調(diào)，兩者的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)。FOXP3可以顯著降低CCSCs的自我跟新能力。FOXP3可能通過與p65相互作用從而抑制NFκB介導(dǎo)的COX2轉(zhuǎn)錄激活。FOXP3通過COX2對CCSCs的自我更新起著負(fù)性調(diào)節(jié)的作用。因此，我們得出結(jié)論：FOXP3可能通過FOXP3/NFκB-COX2信號軸抑制