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文檔簡(jiǎn)介
1、大腸癌(Colorectal Cancer,CRC)作為常見(jiàn)的人類惡性腫瘤,全世界每年大約120萬(wàn)新發(fā)病例,同時(shí)至少60萬(wàn)患者死亡。轉(zhuǎn)移是影響大腸癌患者預(yù)后的重要原因,大多數(shù)伴有轉(zhuǎn)移的大腸癌患者不適合傳統(tǒng)治療方式。大腸癌轉(zhuǎn)移主要與個(gè)體基因突變有關(guān),大腸癌中基因突變不超過(guò)50%,故可認(rèn)定大腸癌的轉(zhuǎn)移尚有其它新的抑癌基因或癌基因在起作用。FAM172A是本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)的一個(gè)新基因,我們最近的研究結(jié)果證實(shí):1)FAM172A在CRC相關(guān)
2、組織中表達(dá)下調(diào),且顯著抑制人大腸癌LoVo細(xì)胞增殖和促進(jìn)凋亡;2)轉(zhuǎn)錄因子STAT1在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控FAM172A表達(dá),增強(qiáng)后者功能。綜上所述,我們推測(cè):FAM172A基因是一個(gè)典型的抑癌基因,進(jìn)一步研究其轉(zhuǎn)錄調(diào)控相關(guān)機(jī)制具有重要意義?;虮磉_(dá)調(diào)控除發(fā)生在轉(zhuǎn)錄水平,轉(zhuǎn)錄后調(diào)控也是關(guān)鍵環(huán)節(jié),miRNAs是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)參與轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控的重要因子。miRNAs是一種由內(nèi)源基因編碼的、長(zhǎng)度大概為22個(gè)核苷酸的非編碼單鏈小RNA分子。研究證實(shí)miR
3、NA異常表達(dá)與大腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān),如miR-21在大腸癌細(xì)胞中表達(dá)明顯增高,并通過(guò)抑制PDCD4表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的侵襲。我們前期工作中利用生物信息學(xué)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)miR-27a可能靶向結(jié)合FAM172A,故我們推測(cè)FAM172A功能可能在轉(zhuǎn)錄后水平受到miR-27a的調(diào)控。本課題擬在前期工作基礎(chǔ)上,在轉(zhuǎn)錄后水平進(jìn)一步闡明FAM172A抑制大腸癌侵襲轉(zhuǎn)移的調(diào)控機(jī)制,為大腸癌的基因治療提供科學(xué)依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
目的:
1、明確FA
4、M172A對(duì)大腸癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響;
2、生物信息學(xué)篩選和驗(yàn)證調(diào)控FAM172A的重要miRNA;
3、明確大腸癌組織及細(xì)胞株中miR-27a表達(dá)水平及其相關(guān)臨床意義;
4、探討miR-27a靶向FAM172A對(duì)大腸癌細(xì)胞遷移和侵襲的影響及其機(jī)制;
方法:
1、構(gòu)建FAM172A重組質(zhì)粒,通過(guò)細(xì)胞劃痕及Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)分別觀察FAM172A對(duì)LoVo細(xì)胞遷移和侵襲的影響
5、;
2、生物信息學(xué)篩選靶向FAM172A的重要miRNA,Luciferase報(bào)告基因技術(shù)驗(yàn)證兩者結(jié)合關(guān)系;
3、RT-qPCR檢測(cè)大腸癌細(xì)胞株及配對(duì)組織標(biāo)本中miR-27a表達(dá)水平。
4、構(gòu)建穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-27a的LoVo細(xì)胞株;細(xì)胞劃痕及Transwell明確miR-27a調(diào)控FAM172A對(duì)大腸細(xì)胞遷移和侵襲影響;western blot檢測(cè)miR-27a調(diào)控FAM172A對(duì)侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)重要信號(hào)通
6、路分子的表達(dá)影響;
5、數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用SPSS22.0軟件分析,以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。計(jì)量資料組間比較采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn),多組間比較采用方差分析。P<0.05為有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。所有實(shí)驗(yàn)均獨(dú)立進(jìn)行三次,取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
結(jié)果:
1、過(guò)表達(dá)FAM172A減弱了LoVo細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速度,引起LoVo細(xì)胞侵襲數(shù)量的減少,干擾FAM172A表達(dá)則加快了LoVo細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速度,增加了其侵襲數(shù)量;
2、FAM172
7、A3'UTR存在miR-27a結(jié)合位點(diǎn)且雙熒光報(bào)告基因證實(shí)轉(zhuǎn)染miR-27a能引起熒光素酶活性下降。
3、在大腸癌相關(guān)組織中miR-27a含量明顯高于正常癌旁組織,臨床病例資料分析顯示其表達(dá)水平與TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與否呈正相關(guān);miR-27a在各人大腸癌細(xì)胞株的表達(dá)均高于正常人大腸上皮細(xì)胞。
4、轉(zhuǎn)染miR-27a導(dǎo)致LoVo細(xì)胞遷移加快和侵襲數(shù)量明顯增加,干擾miR-27a表達(dá)則引起LoVo細(xì)胞遷移和
8、侵襲數(shù)量減少;穩(wěn)定過(guò)表達(dá)miR-27a的LoVo細(xì)胞在導(dǎo)入FAM172A過(guò)表達(dá)質(zhì)粒后,LoVo細(xì)胞遷移減慢及侵襲細(xì)胞數(shù)量減少,且轉(zhuǎn)移相關(guān)重要信號(hào)通路分子MMP-2、MMP-9和NF-κB的蛋白表達(dá)降低。
結(jié)論:
1、FAM172A抑制大腸癌細(xì)胞的遷移和侵襲;
2、miR-27a靶向結(jié)合FAM172A;
3、miR-27a的表達(dá)變化對(duì)診斷和評(píng)估CRC患者病情具有一定的價(jià)值;
4、FAM17
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