低磷酸酯酶癥家系致病突變的分子學(xué)研究肥厚型心肌病家系致病基因的鑒定及其功能研究.pdf

1、本文主要從以下幾部分進(jìn)行論述：
　　第一部分 低磷酸酯酶癥家系致病突變的分子學(xué)研究
　　目的：
　　低磷酸酯酶癥（hypophosphatasia，HPP）是一種罕見的全身骨骼系統(tǒng)性遺傳病，以常染色體隱性或常染色體顯性方式遺傳。目前認(rèn)為ALPL基因突變導(dǎo)致其編碼的TNSALP活性降低，使得血清及骨組織中堿性磷酸酶活性降低導(dǎo)致骨骼和牙齒礦化不全。本研究中，我們對一個(gè)兒童型低磷酸酯酶癥家系進(jìn)行臨床表型分析，對ALPL鑒定分

2、離以及進(jìn)行相關(guān)功能實(shí)驗(yàn)。
　　方法：
　　1.研究對象:來自四川一個(gè)低磷酸酯酶癥家系，先證者是一個(gè)六歲男孩。
　　2.研究方法:通過體格檢查、影像檢查、生化指標(biāo)等對患者進(jìn)行臨床診斷;PCR擴(kuò)增家系成員ALPL基因外顯子并測序篩查突變;PolyPhen-2和SIFT對突變進(jìn)行有害性預(yù)測;利用SOPMA和i-TASSER對ALPL野生型、突變型蛋白結(jié)構(gòu)預(yù)測;使用免疫熒光、熒光定量PCR、免疫印跡、堿性磷酸酶活性檢測等技術(shù)對

3、ALPL野生型、突變型表達(dá)進(jìn)行研究。
　　結(jié)果：
　　根據(jù)臨床表型確診患者患有HPP，確定為常染色體隱性遺傳方式，致病基因?yàn)锳LPL。設(shè)計(jì)引物對家系所有成員ALPL基因外顯子擴(kuò)增，測序顯示先證者存在c.203C＞T和c.571G＞A雙重雜合錯(cuò)義突變。c.203C＞T、c.571G＞A在各物種中高度保守，兩個(gè)位點(diǎn)在PolyPhen-2軟件上預(yù)測均為有害，而SIFT預(yù)測c.203C＞T有害，預(yù)測c.571G＞A為良性。轉(zhuǎn)染HEK

4、-293T后48小時(shí)，c.203C＞T的熒光強(qiáng)度整體減弱，野生型和兩種突變型均以細(xì)胞膜表達(dá)為主，但c.571G＞A細(xì)胞質(zhì)表達(dá)相對野生型增多。轉(zhuǎn)染HEK-293T后24/48小時(shí)qRT-PCR和免疫印跡結(jié)果顯示，兩種突變型的mRNA水平和蛋白表達(dá)量相對野生型均下降。轉(zhuǎn)染HEK-293T后24/48小時(shí)酶活性檢測結(jié)果顯示，c.203C＞T導(dǎo)致蛋白酶活性幾乎完全失活，c.571G＞A導(dǎo)致酶部分失活。
　　結(jié)論：
　　本課題組研究中

5、，該HPP家系先證者ALPL基因存在c.203C＞T和c.571G＞A雙重雜合錯(cuò)義突變。兩種突變的mRNA水平、蛋白表達(dá)量以及TNSALP酶活性均相對野生型降低。因此，我們的結(jié)論是ALPL的c.203C＞T和c.571G＞A突變可降低轉(zhuǎn)錄水平，影響蛋白表達(dá)和翻譯修飾，且導(dǎo)致編碼的TNSALP酶活性下降從而影響其正常功能。本課題首次在中國人群中報(bào)道了ALPL基因c.203C＞T突變和c.571G＞A導(dǎo)致低磷酸酯酶癥，擴(kuò)展了我國ALPL基因

6、的突變譜，且為該家系日后的產(chǎn)前診斷奠定基礎(chǔ)。
　　第二部分 肥厚型心肌病家系致病基因的鑒定和功能研究
　　目的：
　　肥厚型心肌病(Hypertrophic Cardiomyopathy, HCM)是常見遺傳性心血管疾病，常染色體顯性方式遺傳，其發(fā)病率可達(dá)1/500。在本研究中，我們對一個(gè)肥厚型心肌病家系進(jìn)行臨床表型分析，并通過對靶向捕獲測序篩出的TNNI3雙重雜合突變進(jìn)行功能性分析。
　　方法：
　　1.

7、研究對象:一個(gè)肥厚型心肌病家系，先證者是21歲女孩。
　　2.研究方法:通過臨床表型、心電圖、超聲心動(dòng)圖、彩色多普勒等對患者進(jìn)行臨床診斷。對先證者靶向捕獲測序篩出兩個(gè)有意義突變TNNI3的c.235C＞T，c.470C＞T。擴(kuò)增家系所有成員的目標(biāo)序列Sanger測序鑒定突變。生物信息軟件預(yù)測突變的有害性以及蛋白結(jié)構(gòu)。最后，通過細(xì)胞轉(zhuǎn)染、亞細(xì)胞定位以及免疫印跡等技術(shù)對TNNI3野生型、突變型蛋白進(jìn)行研究。
　　結(jié)果：
　

8、　影像檢查確診先證者及其哥哥患肥厚型心肌病，先證者8歲發(fā)病，父母未表現(xiàn)出HCM癥狀。先證者及其哥哥TNNI3基因存在c.235C＞T、c.470C＞T雙重雜合突變，其父攜帶c.235C＞T，其母攜帶c.470C＞T。兩位點(diǎn)在多物種中高度保守，Predict Protein和SIFT預(yù)測c.235C＞T、c.470C＞T均有害，SOPMA和PDB預(yù)測突變體二級、三級結(jié)構(gòu)均改變。轉(zhuǎn)染HEK-293T后24h亞細(xì)胞定位結(jié)果發(fā)現(xiàn)突變型與野生型均

9、在細(xì)胞核中表達(dá)。轉(zhuǎn)染后24h通過Western blot檢測c.235C＞T、c.470C＞T突變蛋白表達(dá)量降低。
　　結(jié)論：
　　該家系先證者及其哥哥皆患有肥厚型心肌病，兩人TNNI3基因均存在c.235C＞T，c.470C＞T雜合突變，其父母各攜帶一個(gè)雜合突變未發(fā)現(xiàn)患病。亞細(xì)胞定位結(jié)果表明突變不影響蛋白定位。免疫印跡實(shí)驗(yàn)證明突變蛋白表達(dá)量相對野生型下降，說明該突變影響TNNI3基因的翻譯或蛋白的穩(wěn)定性。該基因在國內(nèi)的報(bào)道