七甲川花菁染料IR-780用于高纖維化潛能真皮細(xì)胞亞群分選的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、背景：
　　皮膚創(chuàng)傷修復(fù)是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，影響成體皮膚創(chuàng)傷愈合的因素包括細(xì)胞外基質(zhì)、細(xì)胞因子、炎癥細(xì)胞、修復(fù)細(xì)胞等。在修復(fù)過程中原位真皮細(xì)胞是主要的修復(fù)細(xì)胞，能夠轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞，造成大量細(xì)胞外基質(zhì)沉積，并收縮創(chuàng)面，最終導(dǎo)致瘢痕形成。既往研究顯示真皮細(xì)胞具有顯著的異質(zhì)性。譜系示蹤發(fā)現(xiàn)真皮細(xì)胞中含有高纖維化潛能的細(xì)胞亞群，由于真皮細(xì)胞亞群間缺乏特異性的標(biāo)志物，因此，探索鑒別人真皮細(xì)胞亞群的新技術(shù)對于研究真皮細(xì)胞各亞群標(biāo)志物以

2、及在創(chuàng)傷修復(fù)和纖維化過程中的作用具有非常重要的意義。本課題組研究發(fā)現(xiàn)七甲川花菁染料IR-780能夠鑒別高纖維化潛能的真皮細(xì)胞亞群并依賴糖酵解表型，為皮膚纖維化的研究提供了潛在的技術(shù)手段。
　　方法：
　　1.高攝取IR-780真皮細(xì)胞亞群(IR-780H)的分選與生物學(xué)特性的研究CCK-8用于檢測體外IR-780對真皮細(xì)胞的毒性作用，選取安全濃度進(jìn)行標(biāo)記，鑒別出IR-780H真皮細(xì)胞亞群。采用流式分選的方法將其分離，通過近紅

3、外熒光顯微鏡觀察熒光強(qiáng)度驗(yàn)證流式分選的準(zhǔn)確性。通過形態(tài)學(xué)觀察、CCK-8增殖能力檢測法和集落形成能力等指標(biāo)檢測IR-780H真皮細(xì)胞亞群的形態(tài)、增殖能力和自我更新能力。進(jìn)一步Real-time PCR檢測IR-780H真皮細(xì)胞亞群的膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白、糖酵解代謝相關(guān)酶基因的表達(dá)，并使用能量代謝檢測儀檢測其糖酵解活性。
　　2.高攝取IR-780真皮細(xì)胞亞群纖維化相關(guān)特性的研究
　　使用Real-time PCR、免疫熒光和Weste

4、rn blot法檢測IR-780H真皮細(xì)胞亞群的細(xì)胞外基質(zhì)及纖維化相關(guān)因子表達(dá)水平;通過Real-time PCR檢測標(biāo)記條件下的IR-780對細(xì)胞外基質(zhì)及纖維化相關(guān)因子表達(dá)的影響;免疫熒光法檢測IR-780H真皮細(xì)胞亞群α-平滑肌肌動蛋白(α-SMA)的表達(dá)，以及在轉(zhuǎn)化生長因子β1(TGF-β1)刺激下轉(zhuǎn)化為肌成纖維細(xì)胞的能力;觀察體內(nèi)創(chuàng)傷模型移植IR-780H真皮細(xì)胞亞群對創(chuàng)傷愈合的影響，進(jìn)一步明確IR-780H真皮細(xì)胞亞群的纖維化

5、潛能。
　　結(jié)果：
　　1.高攝取IR-780真皮細(xì)胞亞群的分選與生物學(xué)特性的研究
　　通過對IR-780作用于真皮細(xì)胞的毒性實(shí)驗(yàn)，篩選出安全標(biāo)記濃度，成功建立流式分選IR-780H真皮細(xì)胞亞群的方法，同時近紅外熒光顯微鏡下檢測熒光強(qiáng)度證實(shí)了流式分選的準(zhǔn)確性。形態(tài)學(xué)觀察、CCK-8檢測法和集落形成能力檢測發(fā)現(xiàn)IR-780H真皮細(xì)胞亞群相較低攝取IR-780的真皮細(xì)胞亞群(IR-780C)具有更扁平的形態(tài)、較差的增殖能力

6、和較低的自我更新能力。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)IR-780H真皮細(xì)胞亞群細(xì)胞膜轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白OATP1B3、糖酵解代謝相關(guān)酶PFK1、PFK2、LDH基因表達(dá)明顯高于IR-780C;能量代謝檢測發(fā)現(xiàn)IR-780H真皮細(xì)胞亞群糖酵解水平較高，證明IR-780能用于分離存在能量代謝差異的真皮細(xì)胞亞群。
　　2.高攝取IR-780真皮細(xì)胞亞群纖維化相關(guān)特性的研究
　　檢測細(xì)胞外基質(zhì)及纖維化相關(guān)因子水平，發(fā)現(xiàn)IR-780H真皮細(xì)胞亞群表達(dá)Ⅰ型膠原、纖維

7、連接蛋白和多功能蛋白聚糖細(xì)胞外基質(zhì)及纖維化相關(guān)因子TGF-β1、CTGF的水平較IR-780C明顯升高，并證實(shí)IR-780標(biāo)記對真皮細(xì)胞中這些因子的表達(dá)無影響;通過檢測肌成纖維細(xì)胞特異性的標(biāo)志物(α-SMA)發(fā)現(xiàn)IR-780H真皮細(xì)胞亞群在TGF-β1刺激下向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化的能力較IR-780C顯著增強(qiáng);動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，將IR-780H真皮細(xì)胞亞群移植到全層皮膚損傷大鼠模型后能明顯促進(jìn)創(chuàng)面收縮、增強(qiáng)創(chuàng)面局部的膠原沉積。
　　結(jié)