基于達(dá)沙替尼和全反式維甲酸的自組裝共給藥納米系統(tǒng)抗腫瘤的研究.pdf

1、黑色素瘤(Melanoma)是臨床上較為常見的皮膚惡性腫瘤之一，其惡性程度較高、發(fā)展迅速、轉(zhuǎn)移早而廣泛，預(yù)后不良。近年來，黑色素瘤的發(fā)病率逐年升高，嚴(yán)重威脅著人類的健康。傳統(tǒng)的化療藥物選擇性低、毒性大，人體耐受性差。因此，開發(fā)新的具有高選擇性、高效低毒的黑色素瘤靶向治療藥物顯得尤為迫切。有研究發(fā)現(xiàn)酪氨酸蛋白激酶(Tyrosine protein kinases，TPKs)在黑色素瘤中表達(dá)異常，這提示我們TPKs可能是一類新的黑色素瘤的治

2、療靶點(diǎn)。TPKs是控制細(xì)胞增殖、遷移和凋亡的重要蛋白質(zhì)，其介導(dǎo)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與腫瘤的發(fā)生與發(fā)展密切相關(guān)。有研究表明50％以上的原癌基因和癌基因的產(chǎn)物都具有TPKs活性，TPKs異常表達(dá)會造成細(xì)胞增殖調(diào)節(jié)紊亂，進(jìn)而誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生。酪氨酸激酶抑制劑(Tyrosine kinase inhibitors，TKIs)以TPKs為靶點(diǎn)通過抑制細(xì)胞信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)而抑制腫瘤細(xì)胞的增殖、遷移與侵襲，并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡，并在一定程度上克服了傳統(tǒng)的抗腫瘤藥物選擇性

3、差、不良反應(yīng)大等缺點(diǎn)，具有良好的應(yīng)用前景。但腫瘤的發(fā)生和發(fā)展是一個復(fù)雜的、多因素的過程，抑制單一的信號傳導(dǎo)不足以遏制腫瘤的進(jìn)程，如不能解決腫瘤干細(xì)胞等引起的腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移的問題。腫瘤干細(xì)胞(Cancer stem cells，CSCs)即腫瘤內(nèi)“增殖性干細(xì)胞”，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的根源，具有自我更新、多向分化、高致瘤性和耐藥性等特征。目前，對于惡性腫瘤的治療主要采取手術(shù)切除、放療和化療。盡管這些治療方法在很大程度上清除或殺滅了腫瘤組

4、織和細(xì)胞，并延長了腫瘤患者的生存期，但是由于缺乏對CSCs的靶向性而無法真正解決腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和預(yù)后不良等問題，所以往往不能獲得最佳的治療效果。
　　本文結(jié)合腫瘤細(xì)胞的信號傳導(dǎo)和腫瘤干細(xì)胞的生理特征，以達(dá)沙替尼(Dasatinib，DAS)和全反式維甲酸（All-trans retinoic acid，ATRA）為模型藥物，設(shè)計(jì)并制備基于DAS和ATRA的自組裝共給藥納米系統(tǒng)，構(gòu)建抑制TPKs活性和殺傷CSCs的多功能靶向治療腫瘤

5、策略，提高對腫瘤的治療療效，降低復(fù)發(fā)風(fēng)險(xiǎn)。
　　本文第一章主要闡述了DAS和ATRA共給藥抗黑色素瘤的研究背景及目的，為本課題提供理論支持。
　　文本第二章以DAS為模型藥物，以小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞株為體外模型，初步考察了DAS對黑色素瘤的體外作用。MTT實(shí)驗(yàn)證實(shí)了DAS可以有效地抑制B16F10細(xì)胞的增殖，并呈劑量和時(shí)間依賴性。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示DAS對B16F10細(xì)胞的遷移能力有抑制作用。分別用低、中、高三個濃

6、度的DAS處理B16F10細(xì)胞后，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，核裂解隨濃度增加而加劇，并形成凋亡小體，其細(xì)胞凋亡率分別為(34.06±0.83)％、(50.24±1.66)％和(88.91±0.96)％。
　　本文第三章為了解決腫瘤的復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移等問題，以DAS和ATRA為模型藥物，設(shè)計(jì)并制備了基于DAS和ATRA的自組裝共給藥納米粒(DAS/ATRA-NPs)。通過單因素試驗(yàn)考察了DAS和ATRA的投藥量比、油相中乙醇和二氯甲烷體積比、油相

7、與水相體積比及超聲時(shí)間對制備DAS/ATRA-NPs的影響，優(yōu)化了處方和制備工藝。透射電子顯微鏡（Transmission electron microscopy，TEM）下觀察到DAS/ATRA-NPs呈類橢球形，大小均一。用Zetasizer Nano ZS90激光粒度分析儀測得DAS/ATRA-NPs的平均粒徑為（130.350±1.829）nm，多分散指數(shù)(PDI)為（0.247±0.013），Zeta電位為（26.617±0.

8、939）mV。采用超濾法和超速離心法測得DAS和ATRA的包封率均達(dá)80％以上。在含10％乙醇的PBS釋放介質(zhì)中，DAS/ATRA-NPs中DAS和ATRA的釋放速率小于游離藥物，可見DAS/ATRA-NPs具有一定的緩釋效果。DAS/ATRA-NPs在4℃的儲存條件下放置一個月(30d)，其粒徑、PDI及Zeta電位均無明顯變化，未見聚集現(xiàn)象，穩(wěn)定性良好。
　　本文第四章主要以小鼠黑色素瘤B16F10細(xì)胞為體外模型，對DAS/A

9、TRA-NPs進(jìn)行了體外細(xì)胞學(xué)評價(jià)。選用香豆素-6來標(biāo)記DAS/ATRA-NPs，通過流式細(xì)胞術(shù)檢測香豆素-6的熒光強(qiáng)度發(fā)現(xiàn)B16F10細(xì)胞對DAS/ATRA-NPs的攝取具有良好的量效和時(shí)效關(guān)系。激光共聚焦顯微鏡下觀察到香豆素-6標(biāo)記的DAS/ATRA-NPs主要定位在細(xì)胞的胞漿中。在細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)中，MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明DAS和ATRA均能夠抑制B16F10細(xì)胞的增殖，且DAS/ATRA-NPs組的抑制作用強(qiáng)于DAS+ATRA組及ATR

10、A組、DAS組，DAS/ATRA-NPs中DAS和ATRA產(chǎn)生了協(xié)同作用。利用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)及Transwell體外遷移實(shí)驗(yàn)說明藥物處理后細(xì)胞的遷移性發(fā)生改變，DAS/ATRA-NPs能夠有效地抑制B16F10細(xì)胞的遷移，其趨勢與MTT結(jié)果相一致。細(xì)胞凋亡或死亡是腫瘤治療中重要的考察因素，用DAPI染色液染核后發(fā)現(xiàn)，藥物處理后的細(xì)胞出現(xiàn)了明顯的染色質(zhì)固縮、核膜破裂、核裂解等現(xiàn)象。流式細(xì)胞儀定量分析結(jié)果同樣說明了這個問題，DAS/ATRA-

11、NPs可以誘導(dǎo)B16F10細(xì)胞的凋亡并促進(jìn)細(xì)胞的死亡。其細(xì)胞凋亡和死亡率顯著的高于DAS+ATRA組及ATRA組、DAS組(P＜0.05)。接著，本章對DAS/ATRA-NPs中DAS和ATRA的協(xié)同機(jī)制進(jìn)行了初步考察。細(xì)胞球囊形成實(shí)驗(yàn)和側(cè)群細(xì)胞實(shí)驗(yàn)是兩種常用的體外檢測干細(xì)胞的手段。細(xì)胞球囊形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示B16F10細(xì)胞能夠在一定條件下形成細(xì)胞球囊，具有較強(qiáng)的致瘤性和類CSCs樣特性。DAS/ATRA-NPs能夠抑制細(xì)胞球囊的形成，且

12、抑制作用強(qiáng)于其他組別。側(cè)群細(xì)胞實(shí)驗(yàn)結(jié)果與細(xì)胞球囊形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，DAS/ATRA-NPs能夠顯著地抑制B16F10細(xì)胞的類CSCs樣特性，且效果優(yōu)于陽性對照維拉帕米。DAS可以抑制SRC激酶的磷酸化，用Western blot檢測藥物處理后SRC P-Y418和SRC的表達(dá)水平，結(jié)果顯示SRC P-Y418受到藥物調(diào)控表達(dá)水平下調(diào)，且DAS/ATRA-NPs組的SRC P-Y418表達(dá)量明顯小于其他組別。以上實(shí)驗(yàn)說明DAS/ATRA-

13、NPs能通過抑制類CSCs樣特性和SRC激酶的磷酸化發(fā)揮協(xié)同抗黑色素瘤的作用。
　　本文第五章主要考察了DAS/ATRA-NPs的體內(nèi)分布情況。以5×106個細(xì)胞量腋下接種裸鼠，建立皮下異位腫瘤模型。用DiD熒光標(biāo)記DAS/ATRA-NPs，尾靜脈注射考察DAS/ATRA-NPs在荷瘤裸鼠體內(nèi)的分布情況，IVIS Spectrum活體動物成像系統(tǒng)檢測結(jié)果顯示熒光主要分布在肝臟、脾臟及皮下異位腫瘤中。分別于2h和24h處死荷瘤裸鼠并