大黃酸調(diào)控Rac1-ROS-MMPs通路抑制卵巢癌細(xì)胞的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移的作用研究.pdf

1、目的:測(cè)定大黃酸對(duì)卵巢癌淋巴結(jié)定向高轉(zhuǎn)移細(xì)胞（SKOV3-PM4）的遷移、侵襲抑制作用，探討大黃酸對(duì)NADPH氧化酶活性及ROS活性的影響及Rac1/ROS/MMPs信號(hào)通路中MMPs蛋白分子表達(dá)的影響，為研究干預(yù)卵巢癌轉(zhuǎn)移和侵襲提供新途徑。
　　方法:本研究以人卵巢淋巴結(jié)定向高轉(zhuǎn)移能力的亞克隆細(xì)胞(SKOV3-PM4)為研究對(duì)象。采用四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)法檢測(cè)不同濃度大黃酸(rhein)處理SKOV3-PM4細(xì)胞48h后的增

2、殖抑制作用。選擇不同濃度的大黃酸與PMA(Rac1激活劑)，NSC23766（Rac1抑制劑）聯(lián)合作用，將SKOV3-PM4細(xì)胞分為9個(gè)實(shí)驗(yàn)組:①Control;②rhein(7.7μM);③rhein(11.3μM);④單用PMA(100nM））;⑤PMA+rhein(7.7μM);⑥PMA+rhein(11.3μM);⑦單用NSC23766(12.5μM);⑧NSC23766+rhein(7.7μM);⑨NSC23766+rhein

3、（11.3μM）。細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的遷移能力，Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組細(xì)胞的侵襲能力。NBT法檢測(cè)各組細(xì)胞NADPH氧化酶活性的變化;流式細(xì)胞儀檢測(cè)各組細(xì)胞中ROS濃度的變化。Western Blot實(shí)驗(yàn)方法檢測(cè)各組細(xì)胞Rac1/ROS/MMPs信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白及MMPs蛋白表達(dá)水平的變化。
　　結(jié)果:大黃酸能夠抑制SKOV3-PM4細(xì)胞的增殖能力，48h的半數(shù)抑制濃度(IC50)為34.8uM，選擇大黃酸

4、抑制率＜10％的濃度作為本研究的實(shí)驗(yàn)濃度。與對(duì)照組相比.Rac1激活劑PMA處理SKOV3-PM4細(xì)胞48h后，細(xì)胞遷移能力增強(qiáng)，而大黃酸(11.3μM)、PMA+ rhein及NSC23766+ rhein顯著降低SKOV3-PM4遷移能力。各組細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果與Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。PMA處理SKOV3-PM4細(xì)胞48h后，NADPH氧化酶活性升高，而大黃酸(7.7μM及11.3μM)，PMA+ rhein、NSC

5、23766+ rhein處理后細(xì)胞NADPH氧化酶活性降低，與對(duì)照組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。與空白對(duì)照組比較，PMA處理后ROS濃度顯著升高。PMA+ rhein處理后細(xì)胞內(nèi)ROS濃度較單用PMA處理后的低。Western Blot實(shí)驗(yàn)顯示:與空白組相比，大黃酸能顯著抑制磷酸化JNK，AP-1蛋白的表達(dá)水平，單用NSC23766、大黃酸+NSC23766處理組與單用大黃酸處理后作用效果一致。單用大黃酸(11.3μ M)處理，MMP-2，-3，

6、-7，-9及MMP-19蛋白質(zhì)表達(dá)水平較空白對(duì)照組顯著降低。Rac1激活劑PMA處理組MMP-2、MMP-3、MMP-9、MMP-19的蛋白表達(dá)水平均增高，僅MMP-7表達(dá)水平稍有降低。PMA+ rhein(11.3μM)處理后MMP-2，-3，-9，MMP-19較PMA單獨(dú)組處理后顯著降低。NSC23766處理組MMP-7，-9及MMP-19的蛋白表達(dá)水平降低，NSC23766+大黃酸處理，MMP-3，-7，-9，MMP-19蛋白質(zhì)表

7、達(dá)水平較NSC23766單獨(dú)組處理降低，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。與空白組相比，無(wú)論高濃度還是低濃度大黃酸處理組，NM23-H1、TIMP-2和TIMP-1蛋白表達(dá)水平均升高。大黃酸抑制卵巢癌侵襲及轉(zhuǎn)移的能力，可能是通過抑制MAPK通路的JNK，AP-1蛋白磷酸化，進(jìn)一步抑制MMPs，增加TIMP-1、TIMP-2和NM23-H1蛋白表達(dá)而實(shí)現(xiàn)。
　　結(jié)論:大黃酸能夠抑制卵巢癌細(xì)胞的侵襲與轉(zhuǎn)移，其作用機(jī)制可能與抑制Rac1/ROS/MM