第一部分NOK癌基因的糖代謝調(diào)控機(jī)制第二部分干擾素α誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制.pdf

1、本文主要從以下幾方面進(jìn)行論述：
　　第一部分 NOK癌基因的糖代謝調(diào)控機(jī)制
　　糖代謝是滿足細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖的主要能量來(lái)源。正常組織細(xì)胞攝取周圍環(huán)境中的葡萄糖后，首先通過(guò)糖酵解將葡萄糖轉(zhuǎn)化為丙酮酸，在氧氣充足的情況下，丙酮酸隨即進(jìn)入線粒體生成乙酰輔酶A，進(jìn)而參與到線粒體三羧酸循環(huán)(tricarboxylic acidcycle，TCA cycle)中，徹底氧化分解生成水和二氧化碳;在氧氣缺乏的情況下，丙酮酸則大量轉(zhuǎn)化為乳酸，分泌

2、到胞外。而對(duì)于腫瘤細(xì)胞來(lái)說(shuō)，無(wú)限制的快速增殖使得它們對(duì)能量和營(yíng)養(yǎng)成分的需求更加迫切，因此，大多數(shù)腫瘤細(xì)胞會(huì)對(duì)糖代謝過(guò)程進(jìn)行重新編程，主要體現(xiàn)在有氧糖酵解的增加，也就是所謂的瓦伯格效應(yīng)(Warburgeffect)——在氧氣充足的情況下，細(xì)胞仍然以糖酵解作為主要的產(chǎn)能方式，將攝取的幾乎所有葡萄糖轉(zhuǎn)化為乳酸。NOK，即Novel Oncogene with Kinase-domain，是2004年從人扁桃體癌細(xì)胞中分離并命名的一種癌基因，屬

3、于受體蛋白酪氨酸激酶家族（Receptor Protein Tyrosine Kinases，RPTKs），已被證明能夠促進(jìn)體外細(xì)胞的增殖與轉(zhuǎn)化，以及體內(nèi)腫瘤的生成和轉(zhuǎn)移。因此，NOK癌基因很可能也會(huì)引起細(xì)胞能量代謝的改變，然而，關(guān)于NOK介導(dǎo)的腫瘤能量代謝及其調(diào)控機(jī)制目前仍是個(gè)未知數(shù)。旨在從糖代謝的角度入手，探討NOK促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的新機(jī)制。
　　在本研究課題中，利用瞬時(shí)表達(dá)NOK的HEK293T和NIH3T3細(xì)胞系、以及穩(wěn)定

4、表達(dá)NOK的BaF3細(xì)胞系作為研究模型，首次系統(tǒng)地分析了NOK癌基因?qū)μ谴x的調(diào)控作用及分子機(jī)制。結(jié)果提示，NOK癌基因可以明顯增強(qiáng)這些細(xì)胞中的有氧糖酵解水平，這一現(xiàn)象在利用NOK轉(zhuǎn)基因小鼠的血清進(jìn)行葡萄糖/乳酸分析的實(shí)驗(yàn)中也得到了初步驗(yàn)證。隨后，利用Western Blot分析了四種葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白GLUT1-4以及多種糖酵解酶的表達(dá)水平。結(jié)果顯示，NOK介導(dǎo)的葡萄糖攝取增加可能主要通過(guò)GLUT4的轉(zhuǎn)運(yùn)作用來(lái)完成，同時(shí)，NOK能夠選擇性

5、地促進(jìn)某些關(guān)鍵酶類的表達(dá)上調(diào)，并且在不同的細(xì)胞系中存在一定差異?？紤]到糖酵解過(guò)程與下游的線粒體功能密切相關(guān)，因此，NOK在促進(jìn)有氧糖酵解的同時(shí)對(duì)線粒體中的三羧酸循環(huán)、氧化磷酸化等也可能產(chǎn)生影響。通過(guò)免疫熒光染色檢測(cè)到了NOK蛋白與線粒體的共定位。之后的線粒體功能檢測(cè)結(jié)果表明，盡管NOK對(duì)三羧酸循環(huán)的影響比較小，但它可以顯著抑制線粒體內(nèi)的電子傳遞和氧化磷酸化過(guò)程，且這種抑制作用依賴于NOK的線粒體定位。最后，值得注意的是，發(fā)現(xiàn)NOK不僅可

6、以促進(jìn)丙酮酸脫氫酶復(fù)合體(Pyruvate Dehydrogenase Complex，PDC)由線粒體向細(xì)胞核的轉(zhuǎn)移，而且增強(qiáng)了細(xì)胞核中的組蛋白乙酰化水平。這就提示，NOK癌基因介導(dǎo)的腫瘤代謝改變可能會(huì)通過(guò)核PDC相關(guān)的組蛋白乙?；瘉?lái)介導(dǎo)下游靶基因的轉(zhuǎn)錄激活，最終促進(jìn)細(xì)胞的增殖與惡性轉(zhuǎn)化。
　　綜上所述，的研究首次從代謝的角度揭示了NOK癌基因介導(dǎo)腫瘤發(fā)生和轉(zhuǎn)移的機(jī)制，為靶向細(xì)胞糖代謝的腫瘤藥物開(kāi)發(fā)及生物治療提供了新的思路和理論

7、依據(jù)。
　　第二部分 干擾素α誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的分子機(jī)制
　　干擾素α(Interferonα，IFN-α)作為一種細(xì)胞因子，不僅在調(diào)控機(jī)體免疫系統(tǒng)、誘導(dǎo)抗病毒先天免疫應(yīng)答中發(fā)揮著重要作用，而且在抗腫瘤方面也有潛在的應(yīng)用價(jià)值。研究報(bào)道，IFN-α可以促進(jìn)某些腫瘤細(xì)胞的凋亡，且作為敏感劑已被用于治療部分惡性腫瘤，如肝癌(HCC)、惡性黑色素瘤和腎癌(RCC)等。然而，IFN-α在治療宮頸癌方面的應(yīng)用及作用機(jī)制尚未明確。本研

8、究中，利用人宮頸癌細(xì)胞系HeLa作為研究模型，探討了IFN-α對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響及其分子機(jī)制。初步結(jié)果顯示，IFN-α能夠明顯抑制HeLa細(xì)胞的增殖，并促進(jìn)其凋亡。通過(guò)Western Blot檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)IFN-α處理的HeLa細(xì)胞伴有明顯的caspase3活化、促凋亡蛋白Bim和切割的多聚腺苷二磷酸核糖聚合酶-1(PARP1)表達(dá)上調(diào)、抗凋亡蛋白Bcl-xL表達(dá)下調(diào)。研究還顯示IFN-α可促進(jìn)細(xì)胞色素c由線粒體向胞漿的釋放，提示內(nèi)

9、源性線粒體凋亡通路被激活。另外，IFN-α的刺激還導(dǎo)致了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激凋亡途徑中的標(biāo)志性分子caspase4的切割活化。利用RNA干擾(siRNA)技術(shù)抑制caspase4的表達(dá)之后，細(xì)胞總凋亡率明顯降低，但并未影響內(nèi)源性線粒體凋亡通路的活化。然而，IFN-α處理HeLa細(xì)胞后，并未檢測(cè)到外源性死亡受體凋亡通路的標(biāo)志性分子caspase8和caspase10的顯著變化，提示IFN-α誘導(dǎo)的HeLa細(xì)胞凋亡可能不依賴于外源性通路?，F(xiàn)有結(jié)果表明