Wnt信號(hào)相關(guān)胞外拮抗因子遺傳變異與胃癌易感性的關(guān)聯(lián)性及相關(guān)功能學(xué)研究.pdf

1、背景與目的:
　　我國(guó)是胃癌的高負(fù)擔(dān)國(guó)家。據(jù)最新統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)顯示，胃癌在我國(guó)男性腫瘤發(fā)病率中位居第二位，僅次于肺癌;在女性中位列第三位，僅次于乳腺癌和肺癌。盡管早期胃癌經(jīng)手術(shù)治療后，五年生存率達(dá)到90％左右，但早期胃癌往往缺乏典型臨床癥狀，大多數(shù)患者確診時(shí)已進(jìn)入中晚期，錯(cuò)過(guò)最佳治療時(shí)期，導(dǎo)致胃癌在人群中的死亡率較高（胃癌占腫瘤死因的第二位）。闡明影響胃癌發(fā)生相關(guān)危險(xiǎn)因素，并積極采取三級(jí)預(yù)防控制措施對(duì)防治胃癌發(fā)生具有重要的公共衛(wèi)生學(xué)意義

2、。胃癌是一種與環(huán)境密切相關(guān)的腫瘤。幽門螺旋桿菌感染、腌制食品、硝酸鹽、多環(huán)芳烴化合物、煙草與酒精等暴露都被證實(shí)與胃癌的發(fā)生有關(guān)。近年來(lái)，有越來(lái)越多的研究表明，處于相同的環(huán)境暴露下，不同遺傳背景的個(gè)體之間胃癌的易感性也存在差異，說(shuō)明遺傳因素也是影響胃癌發(fā)生的重要因素。
　　這種遺傳性差異在人群中更多的表現(xiàn)為單核苷酸多態(tài)性(SNP)。全基因組關(guān)聯(lián)研究(GWAS)是一種高效的用于篩選遺傳易感位點(diǎn)的研究策略，相關(guān)胃癌GWAS發(fā)現(xiàn)3q13.

3、31(rs9841504)、5p13.1(rs13361707)區(qū)域是中國(guó)人群胃癌的易感區(qū)域。但GWAS陽(yáng)性位點(diǎn)大多位于無(wú)生物學(xué)功能的區(qū)域，對(duì)此存在的統(tǒng)計(jì)學(xué)關(guān)聯(lián)仍然難以解釋;此外GWAS通常采用較高的統(tǒng)計(jì)學(xué)檢驗(yàn)水準(zhǔn)(P＜10-7)，假陰性的出現(xiàn)難以避免。與此同時(shí)，基于候選基因的研究策略研究胃癌的易感性，尤其是對(duì)關(guān)鍵致癌/抑癌基因的易感性研究在闡述胃癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程具有十分重要的作用。
　　腫瘤細(xì)胞干性特征模型表現(xiàn)為具有自我更新的潛

4、能，也用于解釋許多腫瘤表型。盡管腫瘤干性概念仍有爭(zhēng)議，但Wnt信號(hào)在正常和腫瘤干細(xì)胞功能方面的重要作用已得到普遍的認(rèn)同。相對(duì)于前體細(xì)胞而言，干細(xì)胞具有更高的增生能力，且壽命延長(zhǎng)，這樣就有更多的機(jī)會(huì)累積遺傳以及表觀遺傳變異，從而導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。在利用Wnt信號(hào)完成自我更新和修復(fù)的組織中，當(dāng)信號(hào)出現(xiàn)異常激活，腫瘤就會(huì)產(chǎn)生，這一點(diǎn)在結(jié)直腸癌中已被充分證實(shí)。雖然Wnt信號(hào)在胃癌發(fā)生中的作用機(jī)制研究沒(méi)有結(jié)直腸癌中那么地全面和深入，但是在胃癌中普遍

5、存在該信號(hào)的異常激活，并與腫瘤進(jìn)展和轉(zhuǎn)移有關(guān)。
　　和其他重要的信號(hào)通路一樣，Wnt信號(hào)被一系列拮抗因子和激動(dòng)因子調(diào)節(jié)以維持動(dòng)態(tài)平衡。Dickkopfs(DKKs)和secreted frizzled-related proteins(sFRPs)是Wnt信號(hào)通路中重要的胞外抑制因子，分別可以與信號(hào)受體（LRP）和配體(Wnt)結(jié)合，通過(guò)阻礙配體-受體復(fù)合體形成的方式下調(diào)Wnt信號(hào)?；蜻z傳變異，尤其是潛在功能區(qū)域變異與腫瘤發(fā)生風(fēng)

6、險(xiǎn)關(guān)系已得到越來(lái)越多的研究者關(guān)注。在腎癌、膀胱癌以及乳腺癌中發(fā)現(xiàn)DKKs和sFRPs遺傳變異(SNP)與腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)有顯著性關(guān)聯(lián)。但DKKs和sFRPs遺傳變異與胃癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)有無(wú)關(guān)聯(lián)，目前尚未見報(bào)道。
　　本研究擬采用病例-對(duì)照研究設(shè)計(jì)等方法探討DKKs與sFRPs基因功能區(qū)域多態(tài)性與胃癌的風(fēng)險(xiǎn)關(guān)系以及相關(guān)遺傳變異可能的生物學(xué)作用。同時(shí)，利用癌癥基因圖譜The Cancer Genome Altas(TCGA)胃腺癌項(xiàng)目（TCG

7、A-STAD）公開的RNA-seq數(shù)據(jù)初步探討DKKs與sFRPs在胃癌發(fā)生發(fā)展中的作用，并通過(guò)胃癌新發(fā)病例組織標(biāo)本進(jìn)行驗(yàn)證。本研究可以從概率論因果觀的角度為胃癌發(fā)病分子機(jī)理研究提供更多的理論依據(jù)。
　　研究對(duì)象與方法;
　　本研究設(shè)計(jì)首先采用基于醫(yī)院的病例-對(duì)照研究。病例組為經(jīng)組織病理學(xué)確診的原發(fā)性胃癌;患者來(lái)源于江蘇省中醫(yī)院;對(duì)照來(lái)源于江蘇省中醫(yī)院體檢中心，排除癌癥、重大器質(zhì)性病變、嚴(yán)重消化系統(tǒng)疾病。收集時(shí)間均為2008

8、年1月到2012年7月。以DKK(1-4)以及sFRP1為候選基因，利用NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/proj ects/SNP/)篩選位于潛在功能區(qū)域（5'非翻譯區(qū)、外顯子以及3'非翻譯區(qū)），且在北京漢族人群(Han Chinese in Beijing，HCB)最小等位基因頻率＞10％的位點(diǎn)。對(duì)于位于3'非翻譯區(qū)位點(diǎn)，利用在線SNP功能分析預(yù)測(cè)網(wǎng)站SNPinfo(http://snpinfo.n

9、iehs.nih.gov/snpinfo/snpfunc.htm)選擇吉布斯自由能(Energy)絕對(duì)值大于20的miRNA;構(gòu)建pGL3-promoter-SNP重組質(zhì)粒，合成miRNA模擬物(mimics)及陰性對(duì)照miRNA（negative control）。將包含不同等位基因的質(zhì)粒及內(nèi)對(duì)照質(zhì)粒pRL-SV40瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至人胃癌細(xì)胞株MGC803中同時(shí)共轉(zhuǎn)染miRNA模擬物或陰性對(duì)照miRNA，使用雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒檢測(cè)

10、各組螢火蟲/海腎熒光相對(duì)比值，探討miRNA與SNP位點(diǎn)間的調(diào)控關(guān)系。我們基于癌癥基因圖譜The Cancer Genome Altas(TCGA)(https://gdc-portal.nci.nih.gov/)，TCGA-STAD項(xiàng)目RNA-seq數(shù)據(jù)，并聯(lián)合患者人口學(xué)信息、臨床病理學(xué)特征探討DKKs和sFRP1在胃癌與癌旁組織樣本中mRNA表達(dá)量的差異以及mRNA表達(dá)對(duì)預(yù)后的影響，并利用胃癌新發(fā)病例組織樣本進(jìn)行驗(yàn)證，初步推測(cè)DKK

11、s和sFRP1在胃癌發(fā)生和預(yù)后中潛在的生物學(xué)功能。
　　病例組和對(duì)照組間人口學(xué)特征比較采用t檢驗(yàn)和x2檢驗(yàn);擬合優(yōu)度x2檢驗(yàn)用于分析各SNP在對(duì)照人群中是否符合Hardy-Weinberg平衡;多因素Logistic回歸模型用于計(jì)算年齡與性別調(diào)整的比值比（OR值）及其95％可信區(qū)間;采用Bonferroni法進(jìn)行組內(nèi)多重比較校正;采用基于x2分布的Q檢驗(yàn)估計(jì)各亞組間的異質(zhì)性;PHASE2.0用于單倍型的構(gòu)建;Quanto soft

12、ware用于統(tǒng)計(jì)學(xué)把握度的計(jì)算;TCGA數(shù)據(jù)整合和轉(zhuǎn)換采用Perl腳本。運(yùn)用SPSS21.0(International BusinessMachines Corp.，IBM)進(jìn)行數(shù)據(jù)管理，SAS9.1.3(SAS Institute，Inc.，Cary，NC，USA)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。
　　研究結(jié)果:
　　1、本研究在DKKs中共篩選出6個(gè)SNP位點(diǎn):rs2241529(A＞G)、rs3733635(T＞C)、rs1703

13、7102(G＞A)、rs419764(C＞T)、rs3206824(G＞A)、rs2073664(C＞T)。對(duì)這六個(gè)SNP位點(diǎn)在病例組和對(duì)照組中分別進(jìn)行基因分型，并沒(méi)有發(fā)現(xiàn)兩組間存在顯著性的差異(P＞0.05)。
　　2、sFRP1中篩選出2個(gè)位于3'非翻譯區(qū)的SNP位點(diǎn)rs1127379和rs10088390。sFRP1 rs1127379三種基因型(AA、AG、GG)在對(duì)照組中的分布頻率為37.1％、46.1％以及16.8％;

14、在病例組中為42.7％、46.3％以及11.0％。經(jīng)雙側(cè)x2檢驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)這三種基因型在病例組與對(duì)照組中的分布有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（x2=7.652，P=0.022）。經(jīng)調(diào)整年齡性別后，Logistic回歸模型分析發(fā)現(xiàn)與AA基因型相比較，攜帶GG基因型與胃癌風(fēng)險(xiǎn)的降低顯著相關(guān)(OR=0.53，95％CI:0.35-0.81);同時(shí)，與攜帶A等位基因的個(gè)體(AA/AG)相比，隱性模型亦與胃癌風(fēng)險(xiǎn)的降低顯著關(guān)聯(lián)(OR=0.55，95％CI:0.3

15、7-0.81)?；谘芯康臉颖竞?，檢測(cè)到OR=0.53的統(tǒng)計(jì)學(xué)把握度達(dá)到91.66％，OR=0.55時(shí)的統(tǒng)計(jì)學(xué)把握度為88.66％。把握度計(jì)算相關(guān)參數(shù)設(shè)置為:rs1127379的G等位基因頻率為0.4530，胃癌中國(guó)人群患病率估計(jì)(31.8/100000)，遺傳模型則為隱性模型。
　　3、對(duì)胃癌的病理類型和原發(fā)部位進(jìn)行分層分析，rs1127379這種保護(hù)性作用在腸型胃癌(OR=0.53，95％CI:0.34-0.84)與非賁門型

16、胃癌中(OR=0.52，95％CI:0.33-0.82)仍然存在的。而在彌漫型胃癌與賁門癌中則未發(fā)現(xiàn)這種顯著性關(guān)聯(lián)(P＞0.05)。
　　4、根據(jù)年齡、性別、吸煙和飲酒狀況進(jìn)行分層，進(jìn)一步探討分析rs1127379位點(diǎn)的風(fēng)險(xiǎn)效應(yīng)。研究發(fā)現(xiàn)無(wú)論是高齡組還是低齡組，攜帶GG基因型的個(gè)體與攜帶A等位基因的個(gè)體相比，均與胃癌風(fēng)險(xiǎn)的降低顯著相關(guān)（低齡組:調(diào)整OR=0.50，95％CI:0.26-0.94;高齡組:調(diào)整OR=0.57，95％C

17、I:0.35-0.94），且兩者之間同質(zhì)性較好（異質(zhì)性檢驗(yàn)P=0.66）。在男性中，攜帶GG基因型個(gè)體與胃癌風(fēng)險(xiǎn)的降低顯著相關(guān)（調(diào)整OR=0.46，95％CI:0.29-0.73）;在飲酒者中，與胃癌風(fēng)險(xiǎn)的下降具有顯著性的關(guān)聯(lián)（調(diào)整OR=0.26，95％CI:0.08-0.88）;在吸煙者中，GG基因型亦與胃癌風(fēng)險(xiǎn)的降低具有顯著的關(guān)聯(lián)(調(diào)整OR=0.21，95％CI:0.09-0.47)。
　　5、sFRP13'非翻譯區(qū)SNP r

18、s10088390三種基因型CC、CG、GG在病例和對(duì)照組的分布分別為35.1％、47.0％、17.9％以及37.0％、46.9％、16.1％。兩組之間分布經(jīng)雙側(cè)x2檢驗(yàn)無(wú)顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P=0.708)。
　　6、利用PHASE2.0將sFRP1兩個(gè)位于3'非翻譯區(qū)的SNP位點(diǎn)rs1127379與rs10088390構(gòu)建單倍型。結(jié)果推斷出4種單倍型，分別是Ars1127379C rs10088390，A rs1127379G

19、rs10088390，G rs1127379G rs10088390以及G rs1127379C rs10088390。與頻數(shù)最多的Ars1127379Crs10088390相比，A rs1127379G rs10088390與胃癌風(fēng)險(xiǎn)升高具有顯著關(guān)聯(lián)(OR=2.54，95％CI:1.76-3.67)。
　　7、通過(guò)SNPinfo預(yù)測(cè)網(wǎng)站發(fā)現(xiàn)miRNA-1182可特異性地與sFPR1 rs1127379位點(diǎn)A等位基因結(jié)合，且吉布斯

20、自由能絕對(duì)值大于20。采用雙熒光報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)探討miRNA-1182與rs1127379 A＞G位點(diǎn)間的調(diào)控關(guān)系。結(jié)果顯示sFRP1rs1127379 A＞G改變可影響miRNA1182對(duì)其的調(diào)控作用。
　　8、癌癥基因圖譜TCGA27對(duì)胃癌與癌旁組織mRNA表達(dá)差異比較發(fā)現(xiàn)DKK2 mRNA在胃癌組織中的表達(dá)水平顯著地高于相應(yīng)的癌旁組織(P=0.007);DKK4mRNA在胃癌組織中的表達(dá)水平則顯著地低于相應(yīng)的癌旁組織(P＜0.

21、0001);DKK1和DKK3 mRNA表達(dá)水平在癌組織與癌旁組織中無(wú)明顯差異(P＞0.05)。生存分析發(fā)現(xiàn)DKK1低表達(dá)組的五年生存率顯著的高于高表達(dá)組(P=0.0086)。sFRP1mRNA在胃癌組織中的表達(dá)水平顯著地低于相應(yīng)的癌旁組織(P＜0.0001)，利用7對(duì)胃癌新發(fā)病例對(duì)sFRP1mRNA在胃癌和癌旁組織中的差異進(jìn)行驗(yàn)證，并未發(fā)現(xiàn)兩組間存在顯著差異(P＞0.05)。
　　研究結(jié)論:①DKKs潛在功能性SNP位點(diǎn)(rs2

22、241529(A＞G)、rs3733635(T＞C)、rs17037102(G＞A)、rs419764(C＞T)、rs3206824(G＞A)、rs2073664(C＞T))可能與胃癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)無(wú)顯著性關(guān)聯(lián)，同時(shí)未發(fā)現(xiàn)這些SNP位點(diǎn)與人口學(xué)特征、胃癌病理分型以及發(fā)病部位有關(guān);②sFRP1 rs10088390(C＞G)多態(tài)與胃癌發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)沒(méi)有顯著性關(guān)聯(lián);③sFRP1 rs1127379 GG基因型與腸型胃癌以及非賁門胃癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)有關(guān)，且