凋亡抑制蛋白家族在萊菔硫烷抑制腺樣囊性癌ACC-M裸鼠移植瘤中作用的實驗研究.pdf

1、背景：涎腺腺樣囊性癌(salivary adenoid cystic carcinoma，SACC)是一種惡性腫瘤，主要來源于涎腺上皮。具有如下特點：局部浸潤性非常強，極易早期侵犯神經(jīng)和血管，所以癌細(xì)胞容易沿血液擴散到遠(yuǎn)處。采用手術(shù)方法切除腫瘤后，仍然有較高的局部復(fù)發(fā)率和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移率，SACC的肺部轉(zhuǎn)移率遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于頜面部的其它腫瘤。截止目前，人類在SACC方面的相關(guān)研究成果還不能清楚地闡述它的發(fā)病及轉(zhuǎn)移機制，所以我們要繼續(xù)研究SACC的機制

2、，爭取從分子和蛋白的層面，搞清楚腺樣囊性癌的作用機理，為早日在臨床上應(yīng)用新的抗癌方法或抗癌藥物做出貢獻(xiàn)。
　　萊菔硫烷(sulforaphane，SFN)是從十字花科蔬菜中提取出來的一種植物性物質(zhì)，它屬于異硫氰酸鹽(isothiocyanates,ITCS)類，這種物質(zhì)有抗癌功效。我們前期關(guān)于萊菔硫烷的體外研究成果顯示，萊菔硫烷可以提升半胱天冬酶(Caspase)的功能，加速了腫瘤細(xì)胞的凋亡，從而抑制了腺樣囊性癌細(xì)胞系A(chǔ)CC-M，

3、在這個過程中，Bcl-2家族成員也起到了重要作用。
　　凋亡抑制蛋白家族(inhibitor of apoptosis protein, IAP)主要功能是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，可以通過抑制Caspase來抑制細(xì)胞凋亡,還能參與細(xì)胞周期與細(xì)胞分裂的調(diào)節(jié)等。其家族成員共有八位，分別是c-IAP1、c-IAP2、Survivin、Livin、X-IAP、NAIP、Bruce、ILP-2。c-IAP1、c-IAP2、X-IAP能夠直接抑制Cas

4、pase-3、-7、-9，而Survivin不但能夠抑制Caspase-3、-7,還能增強 X-IAP等其它 IAP家族成員的抗凋亡作用。Livin的作用是降低Caspase-3、-7、-9的活性，ILP-2可以調(diào)節(jié)Bcl-2的表達(dá)，并且使其升高，降低Caspase-9的活性，達(dá)到抑制細(xì)胞凋亡的目的。NAIP的研究主要集中在神經(jīng)系統(tǒng)，Bruce可抑制Caspase-9及Smac的活性。在萊菔硫烷抑制腺樣囊性癌細(xì)胞系A(chǔ)CC-M的增殖過程中

5、，凋亡抑制蛋白家族成員是不是起到一定的作用，在經(jīng)過SFN處理的人腺樣囊性癌裸鼠移植瘤組織中，凋亡抑制蛋白是否表達(dá)異常？以往的研究成果尚不能合理的解釋這一問題。
　　目的：觀察移植瘤被萊菔硫烷抑制的過程中，IAP家族成員的作用如何，是否受到抑制，家族中各個成員的表現(xiàn)是否一致，有沒有其它蛋白分子干擾IAP蛋白的作用，研究其可能的分子作用機制，為日后臨床應(yīng)用萊菔硫烷抗癌提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1材料
　　1.1

6、人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞株ACC-M
　　購自上海交大頜面外科實驗室，該細(xì)胞株建于1995年。
　　1.2萊菔硫烷(SFN)
　　購自美國LKT實驗室，純度≥99％。
　　1.3裸鼠
　　自北京軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院購買，雄性10只，4~6周齡，體重為16~20克。
　　1.4抗體
　　從英國Abcam公司購買的X-IAP多克隆抗體，c-IAP2多克隆抗體， c-IAP1多克隆抗體，Livin多克隆抗體,從

7、美國AR公司購買Survivin多克隆抗體，自無錫傲銳東源生物科技有限公司購買二抗酶標(biāo)羊抗小鼠/兔IgG聚合物。
　　2實驗方法
　　2.1細(xì)胞培養(yǎng)
　　將凍存的人涎腺腺樣囊性癌細(xì)胞復(fù)蘇，然后在37度恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞密度達(dá)到要求時，開始傳代，最后收集細(xì)胞懸液。
　　2.2移植瘤的建立
　　碘酊消毒裸鼠的左前背部以及右后背部，然后將細(xì)胞懸液分別注射于上述部位，經(jīng)口腔給藥，實驗組予以萊菔硫烷(6 mmol

8、 SFN/0.1ml PBS)口服，而對照組口服等量的PBS，每周分三次給藥。
　　2.3解剖瘤體
　　三周以后開始將裸鼠處死，然后解剖瘤體，清除掉瘤體表面的血管、壞死組織。然后用石蠟包埋腫瘤組織塊，蠟塊準(zhǔn)備完畢后行免疫組化實驗。2.4免疫組化
　　本實驗采用免疫組化的方法，觀察IAP家族成員中c-IAP1、c-IAP2、Survivin、Livin、XIAP五種蛋白在裸鼠移植瘤組織中的表達(dá)情況，并統(tǒng)計染色陽性細(xì)胞數(shù)目

9、。
　　2.5數(shù)據(jù)的統(tǒng)計處理
　　本研究有實驗、對照兩個組，每組10個樣本，統(tǒng)計每個樣本的隨機5個視野陽性細(xì)胞總數(shù)，用t檢驗的方法進(jìn)行分析，最后得出結(jié)論。
　　結(jié)果：
　　1實驗組中，五個視野中c-IAP1陽性細(xì)胞總數(shù)為1027.2±107.88個，與對照組的1210.6±108.31個相比，陽性細(xì)胞數(shù)明顯減少，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);
　　2實驗組中，五個視野中c-IAP2陽性細(xì)胞總數(shù)為995.4±

10、113.35個，與對照組的1140.30±122.35個相比，陽性細(xì)胞數(shù)減少明顯，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)；
　　3實驗組中，五個視野中Livin陽性細(xì)胞總數(shù)為1038±156.10個，與對照組的1163.5±85.21個相比，陽性細(xì)胞數(shù)減少明顯，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05);
　　4實驗組中，五個視野中Survivin陽性細(xì)胞總數(shù)為547.80±189.77個，與對照組的959.30±179.77個相比，陽性細(xì)胞數(shù)減少

11、非常明顯，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.01);
　　5實驗組中，五個視野中X-IAP陽性細(xì)胞總數(shù)為1072±86.95個，與對照組的1183.2±127.49個相比，陽性細(xì)胞數(shù)減少明顯，有統(tǒng)計學(xué)差異(P<0.05)。
　　結(jié)論：口服萊菔硫烷能夠使人涎腺腺樣囊性癌ACC-M裸鼠移植瘤中IAP家族成員c-IAP1、c-IAP2、Survivin、Livin、XIAP的表達(dá)明顯受到抑制。提示IAP家族成員在萊菔硫烷誘導(dǎo)人涎腺腺樣囊性癌A