泛素連接酶RNF6在惡性血液腫瘤中的功能及其機制研究.pdf

1、第一部分：RNF6在惡性血液腫瘤中功能的初步分析
　　目的：目前，環(huán)指蛋白RNF6在惡性血液腫瘤中的功能及其分子機制尚未報道。本項目首先檢測了RNF6在多發(fā)性骨髓瘤和白血病病人樣本以及細胞株中的表達情況，并利用慢病毒過表達系統(tǒng)和shRNA干擾技術分析RNF6在多發(fā)性骨髓瘤和白血病細胞中的作用，以期闡述RNF6在惡性血液腫瘤中的相關功能。
　　方法：
　　(1)通過q-RT-PCR和RT-PCR方法檢測了病人樣本以及正常

2、骨髓（NBM）樣本中RNF6的mRNA表達水平；
　　(2)利用Immunoblotting技術檢測了RNF6在6種多發(fā)性骨髓瘤細胞株（H929、KMS11、LP1、OCI-My5、OPM2和RPMI-8226）以及7種白血病細胞株（AML2、HL60、NB4、THP1、K562、Jurkat和697）中的表達豐度；
　　(3)通過生長曲線和集落形成實驗檢測過表達RNF6對白血病細胞增殖以及集落形成能力的影響；
　　(

3、4)利用shRNA干擾技術檢測沉默RNF6對白血病細胞增殖的影響；
　　(5)通過臺盼藍染色計數法檢測白血病細胞中過表達RNF6對硼替佐米敏感性的影響。
　　結果：
　　(1)采用q-RT-PCR和RT-PCR對病人樣本和正常骨髓樣本中RNF6的表達進行分析，發(fā)現RNF6的mRNA水平在惡性血液病病人樣本中存在高表達；
　　(2)與正常骨髓樣本相比，RNF6在多發(fā)性骨髓瘤和白血病細胞株中蛋白質水平比較高；

4、　　(3)生長曲線和集落生成實驗表明，過表達RNF6能夠顯著促進白血病細胞生長和集落形成能力；
　　(4) shRNA沉默RNF6能夠明顯抑制白血病細胞的生長；
　　(5)利用慢病毒介導 RNF6，使之在白血病細胞中高表達，可以顯著減弱 K562對硼替佐米的藥物敏感性。
　　小結：
　　RNF6在多種多發(fā)性骨髓瘤和白血病的病人樣本和細胞株中均存在異常高表達。同時，過表達或者沉默RNF6以后，都能顯著地促進或者抑制

5、癌細胞增殖。以上這些結果表明，RNF6可能與惡性血液腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。另外，過表達RNF6可以減弱K562細胞對硼替佐米的藥物敏感性，這提示，RNF6還可能與癌細胞的耐藥性相關。
　　第二部分：5AHQ對RNF6的轉錄調控機制分析
　　目的：已有研究發(fā)現，喹啉類似物5AHQ具有很強的抗多發(fā)性骨髓瘤和抗白血病活性。同時，前期通過DNA Microarray發(fā)現，5AHQ可以顯著影響RNF6的mRNA水平。本項目將進一步闡

6、述RNF6的轉錄調控機制，從而進一步揭示5AHQ抗腫瘤的相關分子機制。
　　方法:
　　(1)多發(fā)性骨髓瘤和白血病細胞株經5AHQ加藥處理24小時后，利用MTT法檢測藥物的細胞毒活性；
　　(2)5AHQ分別處理多發(fā)性骨髓瘤細胞株（OCI-My5和RPMI-8226）和白血病細胞株（AML2和K562）24小時后，提取細胞總蛋白和總RNA，分別經Immunoblotting或者RT-PCR檢測RNF6的蛋白或mRNA水

7、平；
　　(3) UCSC網站預測RNF6的啟動子序列，并構建RNF6的啟動子截斷體，然后利用熒光素酶雙基因報告系統(tǒng)檢測RNF6啟動子截斷體的熒光素酶活性；
　　(4)利用TFSearch軟件預測RNF6核心啟動子上可能的轉錄因子結合位點，并對其進行點突變和缺失突變，檢測預測位點對啟動子活性的影響；
　　(5)利用CHIP實驗檢測Pbx1與RNF6啟動子區(qū)域的結合情況；
　　(6)利用熒光素酶雙基因報告系統(tǒng)檢測P

8、bx1/Prep1/MEIS1對RNF6啟動子活性的影響；
　　(7)利用Co-IP檢測5AHQ對Pbx1/Prep1異源二聚體形成的影響；同時利用熒光素酶雙基因報告系統(tǒng)檢測5AHQ對RNF6核心啟動子活性的影響。
　　結果：
　　(1) MTT結果顯示，5AHQ能夠顯著抑制多發(fā)性骨髓瘤和白血病細胞的存活；
　　(2)5AHQ分別處理骨髓瘤和白血病細胞株后，RNF6的mRNA和蛋白水平均顯著下調，這說明5AHQ可

9、以下調RNF6的轉錄并抑制其蛋白的表達；
　　(3)通過缺失突變分析發(fā)現，-365/-99是RNF6的核心啟動子區(qū)域，具有較強的轉錄活性；
　　(4)利用定點突變和缺失突變技術發(fā)現，RNF6核心啟動子區(qū)域中的Pbx1結合位點能夠顯著調控RNF6的啟動子活性；
　　(5) CHIP實驗結果顯示，Pbx1可以和RNF6啟動子區(qū)域結合；
　　(6)當單轉染Pbx1時，并不能顯著上調RNF6的啟動子活性，而當Pbx1與P

10、rep1共轉染后發(fā)現，可以顯著上調 RNF6的啟動子活性，這說明，Pbx1需要形成異源二聚體后才能調控RNF6的轉錄；
　　(7)5AHQ可以顯著抑制Pbx1/Prep1異源二聚體的形成，以及明顯下調RNF6核心啟動子的活性。
　　小結：
　　進一步證實了5AHQ可以顯著抑制骨髓瘤和白血病細胞存活，并且可以通過抑制Pbx1/Prep1異源二聚體的形成來調控RNF6的轉錄表達。其中也發(fā)現，-365/-99為RNF6的核心

11、啟動子，Pbx1轉錄因子可以介導RNF6的轉錄。
　　第三部分：RNF6泛素化特點的分析
　　目的:RNF6屬于環(huán)指蛋白家族，環(huán)指蛋白家族成員一般都可以發(fā)生自身泛素化。本部分將考察 RNF6的泛素化情況并尋找其特異性泛素化位點，從而進一步揭示RNF6的泛素化機制。
　　方法：
　　(1)分別加入溶酶體抑制劑（NH4Cl和Chloroquine）以及蛋白酶體抑制劑（MG132和Lactacystin）考察RNF6通

12、過何種方式發(fā)生降解；
　　(2)利用免疫共沉淀方法（Co-IP）檢測RNF6的泛素化情況；
　　(3)通過定點突變技術（Lysine突變成Arginine）構建RNF6一系列單點突變體、三點突變體和四點突變體，然后通過MG132處理分析這些突變體的泛素化降解情況；
　　(4)通過CHX Chase實驗檢測WT，K0，K608和K608R蛋白的半衰期；
　　(5)通過轉染一系列不同的去泛素化酶，檢測RNF6的去泛素

13、化情況。
　　結果：
　　(1)蛋白酶體抑制劑MG132和Lactacystin能夠顯著聚集RNF6蛋白，而溶酶體抑制劑NH4Cl和Chloroquine并不能影響RNF6蛋白量，這提示RNF6主要通過蛋白酶體途徑進行降解；
　　(2)通過 Co-IP實驗發(fā)現，RNF6蛋白能夠形成顯著的多聚泛素鏈，同時加入蛋白酶體抑制劑后，RNF6蛋白的多聚泛素鏈明顯增多，這說明RNF6蛋白能夠發(fā)生多聚泛素化；
　　(3)通過點

14、突變分析發(fā)現，RNF6中第608位賴氨酸位點發(fā)生突變后，能夠明顯阻斷RNF6的泛素-蛋白酶體降解，表明K608為RNF6的重要泛素化位點。但是K0（Lysine-free）依然能夠發(fā)生一定程度的泛素化，這說明除了賴氨酸位點外，可能還存在其它的氨基酸位點介導RNF6的泛素化，如半胱氨酸、絲氨酸和蘇氨酸等；
　　(4) CHX Chase實驗表明，K608R顯著延長了RNF6蛋白的半衰期；
　　(5)通過共轉染一系列去泛素化酶質

15、粒發(fā)現，某些DUBs可以明顯上調RNF6的表達水平，其中 USP22得到了進一步的論證。
　　小結：
　　環(huán)指蛋白RNF6主要通過泛素-蛋白酶體途徑進行降解。同時，RNF6能夠發(fā)生多聚泛素化，其中K608為RNF6的重要泛素化位點。另外通過去泛素化酶篩選發(fā)現，USP22可能為RNF6的去泛素化酶。
　　第四部分：RNF6促進GR的泛素化并增強其穩(wěn)定性
　　目的:近期有研究發(fā)現，RNF6作為E3（泛素連接酶）可以介

16、導雄激素受體AR發(fā)生非典型泛素化而促進前列腺癌細胞生長。但在血液病細胞中的機制還不清楚。據此，本項目將探索RNF6是否能夠影響多發(fā)性骨髓瘤細胞中糖皮質激素受體GR的相關功能，從而更進一步闡述RNF6在多發(fā)性骨髓瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。
　　方法：
　　(1)通過Immunoblotting檢測骨髓瘤和白血病細胞株中GR和RNF6的蛋白表達豐度，并檢測骨髓瘤細胞經5AHQ處理后GR和RNF6的蛋白表達趨勢；
　　(2)通過質

17、粒共轉染方法研究RNF6對GR蛋白表達的影響；
　　(3) CHX chase實驗考察RNF6對GR蛋白半衰期的影響；
　　(4) Co-IP分析RNF6與GR是否存在相互作用；
　　(5)利用缺失突變技術構建一系列RNF6與GR的截斷體，再通過Co-IP實驗分析RNF6與GR在哪一區(qū)域發(fā)生相互作用；
　　(6)通過Co-IP分析RNF6能否介導GR發(fā)生泛素化；
　　(7)使用地塞米松（Dex）或MG132

18、處理分析RNF6對Dex誘導的GR降解的影響。
　　結果：
　　(1) RNF6和GR的蛋白表達豐度基本一致，而且不同骨髓瘤細胞經5AHQ處理后發(fā)現，GR和RNF6蛋白表達趨勢一致，這暗示RNF6與GR可能存在一定的關聯(lián)性；
　　(2) RNF6能夠上調外源性和內源性GR蛋白水平，而GR的mRNA水平并沒有發(fā)生變化，這提示RNF6通過影響GR的翻譯后修飾上調GR蛋白水平；
　　(3)通過CHX chase實驗發(fā)現

19、，RNF6能夠延長GR蛋白的半衰期；
　　(4) Co-IP實驗發(fā)現，RNF6與GR存在相互作用關系；
　　(5)缺失突變分析發(fā)現，GR蛋白的531-777區(qū)域與RNF6發(fā)生結合，RNF6蛋白的87-482區(qū)域與GR發(fā)生結合；
　　(6)通過Co-IP實驗發(fā)現，RNF6能夠促進GR發(fā)生非降解型的多聚泛素化，即非典型泛素化；
　　(7) RNF6能夠抑制Dex介導的GR蛋白降解。
　　小結：
　　RNF

20、6與GR存在相互作用，并且RNF6結合在GR的LBD結構域區(qū)域。另外，RNF6作為E3泛素連接酶，能夠促進GR發(fā)生非典型泛素化而導致其發(fā)生穩(wěn)定。同時，RNF6能夠抑制地塞米松所誘導的GR的降解。
　　結論：
　　本研究首先分析了RNF6在多發(fā)性骨髓瘤和白血病病人樣本和細胞株中的表達情況，發(fā)現RNF6存在高表達。另外，通過慢病毒過表達和干擾系統(tǒng)分析發(fā)現，RNF6能夠影響K562細胞的增殖以及對硼替佐米的敏感性，以上這些結果表明

21、RNF6可能與惡性血液腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關。同時發(fā)現，抗血液腫瘤化合物5AHQ能夠影響RNF6的轉錄。進一步對RNF6的啟動子區(qū)域分析發(fā)現，-365/-99為RNF6的核心啟動子區(qū)域，同時轉錄因子Pbx1與TALE家族蛋白如Prep1等形成異源二聚體后，能夠調控RNF6的轉錄表達。而且，5AHQ可以通過抑制Pbx1與Prep1的異源二聚化，從而抑制RNF6啟動子的活化。另外，由于RNF6為環(huán)指家族蛋白，能夠發(fā)生自身泛素化，并主要通過泛

22、素-蛋白酶體途徑進行降解。同時也對 RNF6的泛素化位點進行了分析，發(fā)現RNF6中的賴氨酸位點K608發(fā)生突變后，可以顯著抑制RNF6的泛素化降解，這提示K608為RNF6的重要泛素化位點。然而，K0(Lysine-free)仍然能夠發(fā)生一定程度的泛素化，這表明除了賴氨酸位點外，還存在其它泛素化位點介導RNF6的泛素化，如半胱氨酸、絲氨酸和蘇氨酸等。另外，通過探索RNF6與多發(fā)性骨髓瘤中GR的關系發(fā)現，RNF6與GR能夠發(fā)生結合，并且R