轉(zhuǎn)錄因子Foxo3a在地西他濱誘導(dǎo)MDS細(xì)胞株SKM-1向單核細(xì)胞分化、凋亡、周期阻滯及自噬中的作用研究.pdf

1、第一部分地西他濱對MDS細(xì)胞株SKM-1形分化、周期、凋亡影響及對Foxo3a和其下游相關(guān)分子表達(dá)影響
　　研究目的：
　　1、明確低濃度DAC處理不同時間對SKM-1細(xì)胞分化、周期和凋亡的影響；
　　2、明確SKM-1細(xì)胞中Foxo3a及p-Foxo3a在DAC處理不同時間后的改變；
　　3、明確DAC處理不同時間對SKM-1細(xì)胞周期和凋亡相關(guān)蛋白p21、p27、C-MYC、Bim和FasL表達(dá)的影響。

2、　　研究方法：
　　1、流式細(xì)胞術(shù)檢測DAC處理不同時間后SKM-1細(xì)胞表面分子（CD14和CD11b）的動態(tài)變化；
　　2、流式細(xì)胞術(shù)檢測DAC處理不同時間后SKM-1細(xì)胞周期動態(tài)變化；
　　3、Hochest33342和Annexin-V-FITC/PI雙染法檢測DAC處理0-6d后SKM-1凋亡改變；
　　4、Western Blot檢測DAC處理不同時間后SKM-1細(xì)胞中Foxo3a、p-Foxo3a、p

3、21、p27、C-MYC、Bim和FasL表達(dá)情況。
　　結(jié)果：
　　1、DAC處理后對SKM-1細(xì)胞中粒系分化標(biāo)記物CD11b表達(dá)無顯著改變，但是可以增加單核細(xì)胞分化表面標(biāo)記物CD14的表達(dá)；
　　2、DAC處理后SKM-1細(xì)胞中處于S期細(xì)胞比例降低，細(xì)胞阻滯于G0/G1和G2/M期；
　　3、DAC處理后，SKM-1細(xì)胞凋亡比例升高。DAC處理3d時早期和晚期凋亡細(xì)胞比例均升高，在第6d時，早期凋亡細(xì)胞升高幅

4、度顯著高于晚期凋亡細(xì)胞；
　　4、雖然SKM-1細(xì)胞中有Foxo3a表達(dá)，但是處于失活狀態(tài)的p-Foxo3a水平較高，表明在SKM-1細(xì)胞中，F(xiàn)oxo3a處于失活狀態(tài)。DAC處理可以增加SKM-1細(xì)胞中Foxo3a的水平，并降低p-Foxo3a，使Foxo3a/p-Foxo3a比值升高，活化Foxo3a的轉(zhuǎn)錄活性。SKM-1細(xì)胞中p21和p27表達(dá)微量，但是C-MYC表達(dá)較高，而DAC處理后可以導(dǎo)致p21和p27表達(dá)顯著上調(diào)、C-

5、MYC表達(dá)顯著降低。此外DAC可以上調(diào)凋亡相關(guān)蛋白Bim，但是對FasL表達(dá)的影響不顯著。
　　結(jié)論：DAC可以誘導(dǎo)SKM-1細(xì)胞向單核細(xì)胞分化，伴隨細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡升高。DAC誘導(dǎo)SKM-1分化過程中伴隨Foxo3a表達(dá)升高、p-Foxo3a降低，顯示DAC可以誘導(dǎo)SKM-1細(xì)胞中Foxo3a活化，激活其對下游分子的轉(zhuǎn)錄活性。
　　第二部分 Foxo3a在DAC誘導(dǎo)SKM-1細(xì)胞分化、周期、凋亡中的作用
　　研

6、究目的：
　　1、明確Foxo3a對SKM-1細(xì)胞分化、周期、凋亡的影響；
　　2、明確Foxo3a在DAC誘導(dǎo)SKM-1細(xì)胞分化、周期、凋亡中的作用；
　　研究方法：
　　1、使用siRNA短暫沉默SKM-1細(xì)胞中Foxo3a表達(dá)后，使用流式檢測SKM-1細(xì)胞表面分子CD14和CD11b的變化及凋亡、周期改變，Western Blot檢測相應(yīng)分子表達(dá)變化；
　　2、DAC與Foxo3a siRNA聯(lián)合處理

7、SKM-1后，使用流式檢測SKM-1細(xì)胞表面分子CD14和CD11b的變化及凋亡、周期改變，Western Blot檢測相應(yīng)分子表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1、短暫沉默SKM-1細(xì)胞中Foxo3a表達(dá)后對SKM-1細(xì)胞表面標(biāo)記物CD14、CD11b表達(dá)、周期和凋亡無明顯影響，但是Western Blot檢測結(jié)果顯示，F(xiàn)oxo3a短暫沉默后與周期相關(guān)的p21、p27蛋白和與凋亡相關(guān)的Bim蛋白表達(dá)均降低，原癌蛋白C-MYC表達(dá)

8、上調(diào)；
　　2、DAC與Foxo3a siRNA聯(lián)合處理后可以部分逆轉(zhuǎn)DAC單獨(dú)應(yīng)用所誘導(dǎo)的SKM-1細(xì)胞單核細(xì)胞分化、周期阻滯和凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)，此過程伴隨p21、p27和凋亡相關(guān)蛋白Bim表達(dá)改變，但是對C-MYC無明顯影響。
　　結(jié)論:
　　Foxo3a活化參與了DAC誘導(dǎo)的SKM-1細(xì)胞向單核細(xì)胞分化、周期阻滯和凋亡誘導(dǎo)效應(yīng)，活化誘導(dǎo)的靶基因p21、p27和Bim蛋白表達(dá)上調(diào)可能與此相關(guān)。
　　第三部分 Fo

9、xo3a在地西他濱誘導(dǎo)MDS細(xì)胞株SKM-1自噬中的作用
　　研究目的：
　　1、明確DAC處理對SKM-1細(xì)胞自噬水平及自噬相關(guān)蛋白Atg12、Atg16、Atg5和自噬調(diào)控蛋白Belcin1表達(dá)影響；
　　2、明確Foxo3a對SKM-1細(xì)胞中自噬及其相關(guān)蛋白表達(dá)的關(guān)系及在DAC誘導(dǎo)SKM-1細(xì)胞自噬中的作用。
　　研究方法：
　　1、Western Blot檢測DAC處理不同時間段SKM-1細(xì)胞中自噬

10、標(biāo)記蛋白LC3和自噬相關(guān)蛋白Atg12、Atg16、Atg5、自噬調(diào)控蛋白Belcin1表達(dá)水平；
　　2、SiRNA干擾Foxo3a后觀察Foxo3a表達(dá)下調(diào)在SKM-1細(xì)胞自噬中的作用；
　　3、Foxo3a siRNA與DAC聯(lián)合處理SKM-1細(xì)胞后觀察SKM-1細(xì)胞中自噬標(biāo)記蛋白LC3和自噬相關(guān)蛋白Atg12、Atg16、Atg5及自噬調(diào)控蛋白Belcin1表達(dá)水平改變。
　　結(jié)果：
　　1、DAC處理誘

11、導(dǎo)SKM-1細(xì)胞中自噬標(biāo)記蛋白LC3-I、LC3-II表達(dá)升高及LC3-II/LC3-I比值升高；此外，自噬相關(guān)蛋白Atg12、Atg16、Atg5和自噬調(diào)控蛋白Belcin1在DAC處理后均升高，說明DAC可以上調(diào)SKM-1細(xì)胞自噬水平；
　　2、SiRNA干擾SKM-1細(xì)胞中Foxo3a表達(dá)可以下調(diào)LC3蛋白表達(dá)，其中對LC3-I下調(diào)作用比LC3-II明顯，此過程伴隨Atg12、Atg16Atg5和Belcin1蛋白表達(dá)降低；