小柴胡湯及其寒熱減方抗血清及其蛋白氧化作用的研究.pdf

1、目的：觀察肝細(xì)胞癌（以下簡稱HCC）、2型糖尿?。ㄒ韵潞喎QT2DM）患者血清及血清中脂蛋白、白蛋白的氧化改變，初步探討小柴胡湯及其寒熱減方對血清及血清脂蛋白、白蛋白的抗氧化作用。
　　方法：⑴按《新編常見惡性腫瘤診治規(guī)范·原發(fā)性肝癌》的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn)選取原發(fā)性肝癌實(shí)驗(yàn)對象，2型糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)選取2型糖尿病實(shí)驗(yàn)對象，及正常體檢者。⑵分組、氧化:將肝細(xì)胞癌患者血清、2型糖尿病患者血清、正常體檢者血清分別在標(biāo)號為1～7號的1.5ml塑料管

2、中分別注入150ul血清，再按按以下要求添加試劑：空白管:150ul血清+12ulPBS；對照管:150ul血清+6ulCuSO4+6ulPBS；小柴胡湯管:150ul血清+6ulCuSO4+6ul小柴胡湯藥液；小柴胡湯去柴胡藥液管:150ul血清+6ulCuSO4+6ul小柴胡湯去柴胡藥液；小柴胡湯去黃芩藥液管:150ul血清+6ulCuSO4+6ul小柴胡湯去黃芩藥液；小柴胡湯去半夏藥液管:150ul血清+6ulCuSO4+6ul小

3、柴胡湯去半夏藥液；小柴胡湯去干姜藥液管:150ul血清+6ulCuSO4+6ul小柴胡湯去干姜藥液。上述溶液混勻后，4℃下靜置24小時，然后進(jìn)行一下步驟。⑶測量血清CD、ONOO-、MDA:在紫外分光光度計中，測量方法2血清中0D234、0D280、0D302及0D535。⑷分離脂蛋白、白蛋白:分別吸取方法2中血清50ul，加入EDTA10ul，4℃條件下靜置24h，然后加入PBS10ul，4℃條件下再靜置24h，分別加入蘇丹黑B溶液染

4、料5ul預(yù)染血清，42℃水浴30min，靜置一小時后分別吸取預(yù)染血清25ul點(diǎn)樣，電泳45min，具體步驟如下:量取0.5％瓊脂糖凝膠32ml加熱融化，于42℃水浴箱中冷卻，倒入10cm×7.8cm電泳U型槽，插入配套七齒塑料小凳，等待10min，待凝膠冷卻凝固后除去小凳;按方法2所分(1)-(7)組由左向右分別注入預(yù)染血清25ul;將點(diǎn)樣樣品端置于電泳槽，以電壓132V設(shè)置電泳儀，電泳時間45分鐘，分離脂蛋白。將染液換為考馬斯亮藍(lán)溶液

5、，同法分離白蛋白。⑸檢測脂蛋白CD、ONOO-、MDA:將上述方法4電泳后所得凝膠中的高密度脂蛋白、低密度脂蛋白條帶分別切出，分別用4ml90％乙醇在4℃環(huán)境下浸泡24h，而后吸取1ml浸出上清液，在紫外分光光度計中測量0D234、0D280、0D302及0D535。⑹檢測白蛋白CD、ONOO、巰基:將上述方法4電泳后所得凝膠板中的白蛋白條帶切出，分別用4ml90％乙醇在4℃環(huán)境下浸泡24h，而后吸取1ml浸出上清液按方法7測量巰基，剩

6、余3ml浸出液分別測量CD、ONOO，記錄數(shù)據(jù)。⑺測血清巰基SH:吸取方法2中血清0.1ml，加蒸餾水1ml、6M KI溶液1ml、5％淀粉溶液3滴、PH7.6磷酸緩沖液3.9ml（至總?cè)萘繛?ml）?；靹蚝笾霉鈴?0mm比色杯內(nèi)。然后向比色杯加0.3ml的0.001N碘液。小心混勻，在加入碘液10秒鐘后比色，使用500nm濾光片，以空氣調(diào)零，測500nm波長的光密度。⑻紫外光譜分析血清-藥物相互作用吸取方法2中血清15ul，加入285

7、0ul蒸餾水，4℃環(huán)境靜置4小時后，取上清液置于石英比色杯中，以空氣調(diào)零點(diǎn)，在紫外分光光度計中測190～400nm范圍，以10nm為間隔的光密度值。
　　結(jié)果：①三組血清中，各組對照管CD值皆略高于組內(nèi)空白管CD值，但無統(tǒng)計學(xué)意義;HCC組中小柴胡湯管、小柴胡湯去柴胡藥液管、小柴胡湯去黃芩藥液管、小柴胡湯去半夏藥液管、小柴胡湯去干姜藥液管CD值對比對照管CD值降低，其中小柴胡湯管、小柴胡湯去柴胡藥液管、小柴胡湯去半夏藥液管、小柴胡

8、湯去干姜藥液管CD值對比對照管CD值降低，有明顯統(tǒng)計意義，小柴胡湯去黃芩藥液管CD值對比對照管CD值降低，有統(tǒng)計意義;正常組及T2DM組中，小柴胡湯管、小柴胡湯去柴胡藥液管、小柴胡湯去半夏藥液管、小柴胡湯去干姜藥液管CD值對比對照管CD值降低，有明顯統(tǒng)計意義，小柴胡湯去黃芩藥液管CD值對比對照管CD值降低，無統(tǒng)計意義。②三組血清中，各組空白管ONOO值對比組內(nèi)對照管ONOO值高，對比具有明顯統(tǒng)計意義。HCC組中小柴胡湯管、小柴胡湯去柴胡

9、藥液管、小柴胡湯去半夏藥液管、小柴胡湯去干姜藥液管ONOO值對比對照管ONOO值略有降低，無統(tǒng)計意義，小柴胡湯去黃芩藥液管ONOO值對比對照管ONOO值略有升高，無統(tǒng)計意義;正常組中，小柴胡湯去柴胡藥液管、小柴胡湯去半夏藥液管、小柴胡湯去干姜藥液管ONOO值對比對照管ONOO值略有降低，無統(tǒng)計意義，小柴胡湯管、小柴胡湯去黃芩藥液管ONOO值對比對照管ONOO值略有升高，無統(tǒng)計意義;T2DM組中，小柴胡湯、小柴胡湯去黃芩藥液管、小柴胡湯去

10、半夏藥液管、小柴胡湯去干姜藥液管ONOO值對比對照管ONOO值略有升高，無統(tǒng)計意義，小柴胡湯去柴胡湯藥液管ONOO值對比對照管ONOO值略有降低，無統(tǒng)計意義。③三組血清中，各組空白管MDA值對比組內(nèi)對照管MDA值高，對比具有明顯差異;各組中小柴胡湯管、小柴胡湯去柴胡藥液管、小柴胡湯去黃芩藥液管、小柴胡湯去半夏藥液管、小柴胡湯去干姜藥液管MDA值對比組內(nèi)對照管MDA值皆有降低，皆有明顯統(tǒng)計意義，其中，三組中小柴胡湯去柴胡藥液管均為各實(shí)驗(yàn)組

11、中MDA值最高的。④HCC組高密度脂蛋白空白管CD值低于對照管，對比有明顯統(tǒng)計意義，T2DM組高密度脂蛋白小柴胡湯去柴胡藥液管CD值低于對照管，對比有統(tǒng)計意義;HCC組低密度脂蛋白空白管CD值低于對照管，對比有明顯統(tǒng)計意義，正常組低密度脂蛋白空白管CD值低于對照管，對比有統(tǒng)計意義;HCC組低密度脂蛋白小柴胡湯去半夏藥液管ONOO值低于對照管，對比有統(tǒng)計意義，正常組低密度脂蛋白小柴胡湯去半夏藥液管、小柴胡湯去干姜藥液管ONOO值低于對照管

12、，對比有統(tǒng)計意義，T2DM組低密度脂蛋白小柴胡湯去柴胡藥液管ONOO值低于對照管，對比有統(tǒng)計意義;T2DM組高密度脂蛋白小柴胡湯管、小柴胡湯去干姜藥液管MDA值低于對照管，對比有統(tǒng)計意義，正常組低密度脂蛋白小柴胡湯去柴胡藥液管、小柴胡湯去黃芩藥液管、小柴胡湯去干姜藥液管MDA值低于對照管，對比有統(tǒng)計意義。⑤正常組、T2DM組對照管SH值皆高于空白管，升高值有明顯統(tǒng)計意義。HCC組中，對照管SH值略低于空白管SH值，降低值有明顯統(tǒng)計意義，

13、小柴胡湯管、小柴胡湯去柴胡藥液管、小柴胡湯去黃芩藥液管、小柴胡湯去半夏藥液管、小柴胡湯去干姜藥液管SH值皆高于對照管SH值，差異具有明顯統(tǒng)計意義;正常組中，小柴胡湯管、小柴胡湯去柴胡藥液管、小柴胡湯去黃芩藥液管、小柴胡湯去半夏藥液管、小柴胡湯去干姜藥液管SH值皆低于對照管SH值，其中小柴胡湯去柴胡藥液管SH值較對照管SH值降低具有統(tǒng)計意義，其余管SH值較對照管降低值均具有明顯統(tǒng)計意義;T2DM組中，小柴胡湯管、小柴胡湯去干姜藥液管SH值

14、較對照管SH值有所升高，升高值具有明顯統(tǒng)計意義，小柴胡湯去半夏藥液管SH值較對照管SH值升高，升高值有統(tǒng)計意義，小柴胡湯去柴胡藥液管、小柴胡湯去干姜藥液管SH值較對照管SH值略有降低，降低值具有明顯統(tǒng)計意義。
　　結(jié)論：⑴小柴胡湯作為中醫(yī)學(xué)中和解少陽的代表方劑，被廣泛用于臨床多種疾病，現(xiàn)代藥理研究也發(fā)現(xiàn)了其抗氧化功效，本實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn):小柴胡湯及其寒熱減方對HCC患者血清、T2DM患者血清、正常人血清有抗氧化作用，對T2DM患者血清

15、、正常人血清的抗氧化作用明顯。⑵小柴胡湯對T2DM患者血清高密度脂蛋白有抗氧化作用;小柴胡湯去柴胡藥液對T2DM患者血清高密度脂蛋白及低密度脂蛋白有抗氧化作用，對正常人血清低密度脂蛋白有抗氧化作用;小柴胡湯去黃芩藥液對正常人低密度脂蛋白有抗氧化作用;小柴胡湯去半夏藥液對HCC患者血清低密度脂蛋白、正常人低密度脂蛋白有抗氧化作用;小柴胡湯去干姜藥液對T2DM患者血清高密度脂蛋白、正常人血清高密度脂蛋白及低密度脂蛋白有抗氧化作用。⑶小柴胡湯