ZAG與FASN交互作用在調節(jié)腸癌惡性表型中的作用及其機制.pdf

1、背景與目的：
　　腫瘤惡性生物學行為與其特殊的物質能量代謝密切相關，異常的物質能量代謝已成為腫瘤細胞新的生物學特性并越來越受到關注。鋅-α2-糖蛋白(Zinc-α2-glycoprotein，ZAG)基因定位于染色體7q22.1，其編碼42kDa的分泌性蛋白，體內實驗證實ZAG能強烈促進脂肪分解，多種腫瘤中ZAG表達常下調，而脂肪酸合成酶(Fatty acid synthase，F(xiàn)ASN)與哺乳動物雷帕霉素(Mammalian t

2、arget of rapamycin，mTOR)信號通路活性常上調，另有報道稱FASN、Akt/mTOR信號通路參與多種腫瘤細胞的物質能量代謝，但三者在腸癌細胞物質能量代謝過程中的相互作用機理并不清楚。本研究旨在探討ZAG與FASN交互作用對腸癌細胞惡性生物學行為的影響及其作用機制。以期進一步明確相關分子在大腸癌發(fā)病過程中的作用，為大腸癌的分子診斷和靶向治療提供實驗依據(jù)。
　　方法：
　　1.RT-PCR與Western b

3、lot檢測腸癌細胞系LoVo/HT-29/Caco-2/HCT-116中ZAG基因及蛋白的表達，選取ZAG表達低的細胞株作為后續(xù)實驗的靶細胞。
　　2.構建ZAG過表達質粒及其空載質粒，轉染靶細胞株，觀察轉染效率，RT-PCR與Western blot檢測轉染后ZAG基因及蛋白表達。
　　3.RT-PCR檢測轉染前后LoVo細胞FASN、mTOR、Akt等相關信號通路基因的表達;Western blot檢測轉染前后LoVo細

4、胞FASN、t-mTOR、p-mTORser2448、t-Akt、p-Aktser473等相關信號通路蛋白的表達。
　　4.檢測過表達ZAG質粒及其空載質粒轉染靶細胞后ATP水平的變化，并檢測各組細胞上清中乳酸水平改變，研究ZAG對腸癌細胞能量代謝的影響。
　　5.MTT增殖實驗、克隆形成實驗以及Transwell實驗檢測ZAG過表達對腸癌細胞株增殖、侵襲和遷移能力的影響，使用碘化丙啶(Propidium iodide，PI

5、)標記各組靶細胞，流式細胞術檢測轉染ZAG前后靶細胞細胞周期的變化。
　　6.不同濃度(0.001μM，0.01μM，0.1μM，1μM，10μM)的FANS特異性淺藍菌素(Cerulenin)作用于腸癌細胞HT-29和LoVo細胞株，藥物毒性實驗檢測淺藍菌素對腸癌細胞的半數(shù)抑制濃度(Inhibitory concentration of50％，IC50)。
　　7.QRT-PCR和Western blot檢測Cerulen

6、in處理組、DMSO對照組和空白組細胞中ZAG、FASN、t-mTOR、p-mTORser2448、t-Akt、p-Aktser473等相關分子的表達。
　　8.使用Cerulenin處理HT-29和LoVo細胞，檢測處理組和對照組細胞中ATP水平及培養(yǎng)基中乳酸變化，觀察Cerulenin對各組腸癌細胞能量代謝的影響。
　　9.細胞克隆形成實驗、Transwell小室實驗檢測Cerulenin對各組腸癌細胞增殖、侵襲和遷移能

7、力的影響，流式細胞術檢測Cerulenin對LoVo和HT-29細胞細胞凋亡的影響。
　　結果：
　　1.RT-PCR結果顯示，與HT-29/Caco-2/HCT-116腸癌細胞相比，LoVo細胞中ZAG基因相對表達最低（0.46±0.05）(P＜0.05），Western blot檢測4株腸癌細胞中ZAG蛋白的表達，結果提示LoVo細胞中ZAG蛋白相對表達（0.43±0.05）最低(P＜0.05），因此本章實驗選取LoVo

8、細胞作為靶細胞。
　　2.使用pGCMV/EGFP/Neo/ZAG質粒及其空載質粒轉染LoVo細胞，熒光顯微鏡觀察綠色熒光表達情況，實驗組與空載質粒組均有較高的轉染效率，使用抗性基因成功篩選穩(wěn)定轉染細胞株，RT-PCR證實轉染pGCMV/EGFP/Neo/ZAG質粒后的LoVo細胞ZAG基因相對表達增加（0.65±0.05）（P＜0.05），Western blot顯示與其它對照組相比實驗組ZAG蛋白相對表達增加（0.67±0.0

9、6）(P＜0.05）?？蛰d質粒組和空白組ZAG表達無差異(P＞0.05)。
　　3.RT-PCR結果顯示;與空載質粒組和空白組相比，轉染ZAG質粒的LoVo細胞中FASN基因相對表達(0.55±0.08)下調(P＜0.05），但mTOR基因(0.81±0.06)與Akt基因(0.78±0.06)相對表達與對照組相比無統(tǒng)計學差異;Western blot結果顯示，與空載質粒組和空白組相比，轉染過表達ZAG質粒的LoVo細胞FASN(

10、0.61±0.06)、p-mTORser2448(0.53±0.08)和p-Ak tser473(0.58±0.10)相對表達下調(P＜0.05），t-mTOR(0.97±0.13)和t-Akt(0.83±0.14)相對表達無統(tǒng)計學差異(P＞0.05)。
　　4.與空載質粒轉染組和空白組相比，轉染過表達ZAG質粒的LoVo細胞內ATP含量(611.23±97.37mmol/grot)降低，細胞上清中乳酸的濃度（29.84±5.04

11、mmol/L）也同時降低(P＜0.05）。
　　5.MTT實驗顯示與空載質粒組和空白組相比，過表達ZAG的LoVo細胞的增殖能力（0.79±0.08）減弱;克隆形成實驗結果顯示實驗組LoVo細胞細胞克隆形成率降低（4.38％±0.71％）;Transwell小室實驗結果提示轉染ZAG過表達質粒的LoVo細胞穿過半透膜的數(shù)量（64.33±8.02）明顯減少;使用PI標記各組細胞，流式細胞術檢測顯示實驗組LoVo細胞G2期的細胞比例（

12、29.47％±2.03％）增高(P＜0.05）。
　　6.使用一系列Cerulenin濃度處理HT29和LoVo細胞48h后，二者增殖率分別是(82.34±5.38％，74.78±9.44％，66.21±4.37％，60.16±9.95％，38.05±8.26％)和(83.45±7.86％，75.05±9.11％，63.93±4.48％，45.59±11.42％，21.68±6.87％)，Cerulenin處理HT29和LoVo細

13、胞的IC50分別是1.93μM和0.37μM，使用此Cerulenin濃度和配對的DMSO濃度進行本部分后續(xù)實驗。
　　7.RT-PCR結果顯示，經(jīng)Cerulenin處理后的HT-29和LoVo細胞株ZAG基因(0.37±0.06和0.29±0.06)表達水平較空白組和DMSO組降低(P＜0.05)，mTOR基因(0.76±0.14和0.85±0.10)和Akt基因(0.64±0.06和0.78±0.08)相對表達與DMSO組和空

14、白組相比無統(tǒng)計學差異;Western blot結果顯示，與空白組和DMSO組相比，經(jīng)Cerulenin處理的HT-29和LoVo細胞株FASN表達（0.34±0.08和0.52±0.04）、ZAG(0.38±0.05和0.21±0.04)、p-mTORser2448(0.42±0.03和0.44±0.01)和p-Aktser473(0.55±0.10和0.58±0.10)相對表達降低(P＜0.05），但t-mTOR(0.90±0.10和

15、0.88±0.10)和t-Akt相對表達(0.80±0.16和0.85±0.11)無統(tǒng)計學差異(P＞0.05）。
　　8.實驗組HT29和LoVo細胞中ATP的含量（449.60±94.81mmol/grot和528.73±37.43mmol/grot）較DMSO組和空白組降低(P＜0.05），同時培養(yǎng)基中的乳酸水平（24.20±3.05mmol/L和29.78±2.10mmol/L）也較DMSO組和空白組降低(P＜0.05），D

16、MSO組與空白組未見ATP或乳酸差異。
　　9.實驗組HT29和LoVo細胞克隆形成率降低（6.36％±1.07％和11.16％±1.46）（P＜0.05）;同時FANS的抑制也誘導了HT29和LoVo細胞侵襲能力（80.33±12.40和96.67±16.27）的降低(P＜0.05);Cerulenin誘導HT29和LoVo細胞凋亡率（37.41％±8.48％和31.28％±3.98％）增加。
　　結論：
　　1.Z

17、AG過表達質粒構建并成功轉染入LoVo細胞，過表達ZAG可抑制Akt/mTOR通路活性，進而抑制FASN的表達，最終阻滯腫瘤細胞惡性生物學行為（細胞增殖、侵襲能力、凋亡和細胞周期）及能量代謝。
　　2.FASN的抑制導致Akt/mTOR通路活性降低，進一步影響ZAG的表達，最終阻滯腸癌細胞惡性生物學行為（細胞增殖、侵襲能力、凋亡和細胞周期）及能量代謝。
　　3.ZAG與FASN交互作用可調節(jié)腸癌細胞的能量代謝及其惡行性，且此