外周血及支氣管肺泡灌洗液異常細(xì)胞檢測在肺癌輔助診斷中的價(jià)值研究.pdf

1、目的：
　　目前，肺癌是世界范圍內(nèi)發(fā)病率及死亡率最高的惡性腫瘤，約18％的癌癥死亡與肺癌有關(guān)[1,2]。吸煙已被證實(shí)為肺癌發(fā)病的主要因素。在我國肺癌也是死亡率最高的惡性腫瘤，約占總數(shù)的22.7%。肺癌患者的5年生存率不足15％，主要原因是約75％的患者在診斷時(shí)已屬晚期肺癌，錯(cuò)過了最佳的根治性手術(shù)時(shí)期[4]。同時(shí)肺癌的治療還面臨著其他問題，包括鱗癌的化療有效率不高、腺癌的靶向治療出現(xiàn)較早耐藥等問題[8]。
　　因此，早發(fā)現(xiàn)、早

2、診斷、早治療等早期措施是降低肺癌死亡率的關(guān)鍵。常規(guī)體檢是早期發(fā)現(xiàn)肺癌的重要途徑，主要包括血清腫瘤標(biāo)記物檢測和胸部影像學(xué)篩查。其中的一部分腫瘤標(biāo)記物可以在病灶很小的時(shí)候即被檢測出來，有助于早期發(fā)現(xiàn)惡性病變。但與此同時(shí)，利用這種方式診斷腫瘤存在兩個(gè)主要問題，首先，腫瘤標(biāo)記物并不是只有腫瘤細(xì)胞能夠分泌的，當(dāng)超過正常指標(biāo)時(shí)，必須鑒別到底是由良性疾病還是惡性疾病引起。因此，僅靠測定腫瘤標(biāo)記物是不能診斷腫瘤的；其次，在腫瘤早期時(shí)，超過標(biāo)準(zhǔn)值的程度較

3、低，異常升高是否就可以代表著惡性病灶的存在；因此在早期腫瘤的篩查過程中，使用腫瘤標(biāo)記物這一方法目前還有不小的盲區(qū)。所以，對(duì)于肺癌沒有一種敏感性和特異性均足夠理想的腫瘤標(biāo)記物。
　　肺癌診斷的金標(biāo)準(zhǔn)為病理活檢，即利用不同的方式獲取病變組織，通過病理檢查發(fā)現(xiàn)癌細(xì)胞確診。但是對(duì)于早期病灶不明顯或者病灶位置較為特殊，難以獲得滿意的組織標(biāo)本，病理結(jié)果出現(xiàn)陰性而造成一定程度的漏診。臨床針對(duì)肺癌的預(yù)防措施主要以盡早發(fā)現(xiàn)，并在病灶還未發(fā)生擴(kuò)散時(shí)就

4、通過手術(shù)措施將其切除，如果發(fā)現(xiàn)時(shí)腫瘤已經(jīng)發(fā)展至III期或者IV期，則治療方式以化療及綜合治療為主，治愈率并不理想，所以肺癌的早期診斷則顯得尤為重要。影像學(xué)檢查和血清腫瘤標(biāo)志物檢測在敏感性和特異性方面并不十分可靠。影像學(xué)的方法只能發(fā)現(xiàn)直徑≥1cm（約1g，109個(gè)癌細(xì)胞）的結(jié)節(jié)，而存在于循環(huán)血液中的癌細(xì)胞和其他器官中的微小轉(zhuǎn)移灶則不能檢測。
　　所以是否可以建立一種檢測手段，在腫瘤發(fā)展的初期，即使尚未形成影像學(xué)的可見病灶，就可以對(duì)患

5、者的病變情況進(jìn)行一定的評(píng)估，建立一種敏感性和特異性相對(duì)樂觀的檢測方法，協(xié)助肺癌患者的診斷。循環(huán)腫瘤細(xì)胞（Circulating Tumor Cell,CTCs）是指在腫瘤發(fā)展的初期，即使還沒有形成現(xiàn)已有的醫(yī)學(xué)手段可檢測到的原發(fā)病灶，就可以通過特殊的方式進(jìn)入血液循環(huán)的一種異常細(xì)胞，由于其在腫瘤的早期發(fā)現(xiàn)、輔助診斷、療效評(píng)價(jià)等方面存在積極指導(dǎo)意義而成為臨床研究熱點(diǎn)。在纖維支氣管鏡檢查基礎(chǔ)上發(fā)展的支氣管肺泡灌洗技術(shù)（bronchoalveol

6、ar lavage，BAL）是臨床常用的一種檢查方法，其優(yōu)點(diǎn)包括簡單易行，安全性高。但是臨床常用的脫落細(xì)胞檢測方法用以在支氣管肺泡灌洗液中查肺癌細(xì)胞存在著陽性率極低的限制，所以目前針對(duì)支氣管肺泡灌洗液中異常脫落細(xì)胞的檢測尚無報(bào)導(dǎo)。
　　本研究利用免疫磁珠陰性選擇富集法和免疫熒光原位雜交法對(duì)外周血中的CTCs及支氣管肺泡灌洗液中的異常脫落細(xì)胞進(jìn)行檢測，評(píng)價(jià)兩種方法在肺癌輔助診斷中的價(jià)值。
　　第一部分：循環(huán)腫瘤細(xì)胞檢測在肺癌輔

7、助診斷中的價(jià)值
　　一、目的：檢測肺癌患者外周血中循環(huán)腫瘤細(xì)胞情況，探討循環(huán)腫瘤細(xì)胞的檢測對(duì)于肺癌的輔助診斷價(jià)值。
　　二、對(duì)象：
　　入選標(biāo)準(zhǔn)：
　　占位組：2015年4月至2015年12月于廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院呼吸內(nèi)科接受診斷治療，影像學(xué)存在占位性病變，一個(gè)月內(nèi)未接受放化療及靶向治療，為明確病變性質(zhì)而進(jìn)行初診的患者220名。
　　非占位組：慢性咳嗽等影像學(xué)無明顯占位患者15名。
　　排除標(biāo)準(zhǔn)：

8、
　　1)入組前1個(gè)月內(nèi)曾接受腫瘤相關(guān)治療；
　　2)伴隨其他惡性腫瘤或入組前5年內(nèi)診斷有其他惡性疾??；
　　3)樣本出現(xiàn)血塊凝結(jié)；
　　4)受試者全血樣本體積少于5mL；
　　5)受試者全血樣本出現(xiàn)溶血。
　　三、方法：
　　1、分別采集235名患者在進(jìn)行治療之前的血液5ml，利用免疫磁珠陰性選擇富集法（Immunomagnetic negative selection，IMNS）和免疫熒光原

9、位雜交法（Immune fluorescence in situ hybridization，imFISH）處理血液標(biāo)本，計(jì)算其中的CTCs數(shù)量。
　　2、根據(jù)患者最終病理結(jié)果判定病灶性質(zhì)，用受試者工作特征曲線（Receiver operating characteristic curve，ROC曲線）分析最佳判定病灶性質(zhì)的細(xì)胞數(shù)量臨界值（CUT-OFF值），與以往研究進(jìn)行對(duì)比是否一致，評(píng)估此臨界值對(duì)病灶性質(zhì)判斷的敏感性和特異性。

10、
　　3、分析CTCs數(shù)量與患者是否發(fā)生肺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移之間的關(guān)系。
　　四、結(jié)果：
　　1、一般資料：235名患者中，3例年齡超過80歲、2例接受過化療、2例合并其他腫瘤，因不符合入組標(biāo)準(zhǔn)而出組，其余228名患者納入本研究。最終經(jīng)病理確診，197例患者為肺癌，31例為肺部良性病變。
　　2、占位組與非占位組間CTCs數(shù)量對(duì)比：213例占位組患者中，檢測到的CTCs均值為5.46±8.74個(gè)，15例非占位組患者中，檢

11、測到的CTCs均值為0.13±0.35個(gè)，兩組數(shù)據(jù)相比有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P＜0.001）。
　　3、占位組患者中良性占位與肺癌CTCs數(shù)量對(duì)比：213例占位組患者中，病理確診肺癌197例，肺部良性占位16例。197例肺癌患者中，檢測到的CTCs數(shù)為5.78±8.98個(gè)，16例良性占位中，檢測到的CTCs數(shù)為1.56±2.99個(gè)，兩組數(shù)據(jù)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。
　　4、良性占位患者與非占位組患者CTCs數(shù)量對(duì)

12、比：16例良性占位中，檢測到異常脫落細(xì)胞數(shù)為1.56±2.99個(gè)，20例非占位性病變患者中，檢測到異常脫落細(xì)胞數(shù)為0.13±0.35個(gè)，兩組數(shù)據(jù)之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.110）。
　　5、CUT-OFF值計(jì)算：進(jìn)一步做ROC曲線分析，當(dāng)血液標(biāo)本中CTCs數(shù)量大于等于2個(gè)時(shí)，患者為肺癌的可能性最大，敏感度為81.7%，特異度為87.1%，曲線下面積（AUC）為0.862，P=0.000,95%置信區(qū)間為0.786-0.938。

13、
　　6、轉(zhuǎn)移組與非轉(zhuǎn)移組間對(duì)比：CTCs數(shù)量陽性組發(fā)生肺癌轉(zhuǎn)移的患者數(shù)量明顯高于陰性組患者（88/150例和13/35例，P=0.021)。同時(shí)發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的患者血液中檢測到的CTCs數(shù)目明顯高于未發(fā)生轉(zhuǎn)移患者（6.08±7.46個(gè)和4.56±7.53個(gè)，P=0.026）。
　　五、結(jié)論：
　　外周血CTCs可以作為一種肺癌輔助診斷的檢測方法，對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移有一定的預(yù)測價(jià)值。
　　第二部分：支氣管肺泡灌洗液異常脫落

14、細(xì)胞檢測在肺癌輔助診斷中的價(jià)值
　　一、目的：了解肺癌患者支氣管肺泡灌洗液中異常脫落細(xì)胞情況，評(píng)價(jià)異常脫落細(xì)胞檢測在協(xié)助肺癌診斷中的價(jià)值。
　　二、對(duì)象：
　　入選標(biāo)準(zhǔn)：
　　占位組：2015年8月至2016年1月于廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院支氣管鏡中心行支氣管鏡檢查，影像學(xué)存在占位性病變，疑似為肺癌的患者，一個(gè)月內(nèi)未接受放化療及靶向治療，為明確病變性質(zhì)而進(jìn)行初診的患者80名。
　　非占位組：慢性咳嗽等影像學(xué)

15、無明顯占位20名。
　　排除標(biāo)準(zhǔn)：
　　1)入組前1個(gè)月內(nèi)曾接受腫瘤相關(guān)治療；
　　2)伴隨其他惡性腫瘤疾病或入組前5年內(nèi)診斷有其他惡性疾?。?br>　　3)受試者自身情況不允許或不愿意接受支氣管鏡檢查；
　　4)受試者未能獲得滿意的肺泡灌洗液（如患者劇烈咳嗽、病灶位置不明確、大出血、一般情況欠佳）。
　　三、方法：
　　1、占位組患者于病灶所在支氣管行肺泡灌洗，非占位組患者于右中葉行肺泡灌洗，收集灌

16、洗液20ml。
　　2、采用免疫磁珠陰性選擇富集法和免疫熒光原位雜交法處理100名患者的支氣管肺泡灌洗液，計(jì)算其中異常脫落細(xì)胞數(shù)量。
　　3、根據(jù)患者最終病理結(jié)果判定病灶性質(zhì)，用ROC曲線分析最佳判定病灶性質(zhì)的CUT-OFF值，評(píng)估此臨界值對(duì)病灶性質(zhì)判斷的敏感性和特異性。
　　四、結(jié)果：
　　1、一般資料：100名患者中，1名患者曾經(jīng)多次化療，1名患者13年確診膽管癌，2名患者未明確診斷，實(shí)際有效病例96例（占位

17、組76例，非占位組20例）。76例患者最終經(jīng)病理確診，56例患者為肺癌，20例患者為肺良性病變。
　　2、占位組與非占位組異常脫落細(xì)胞數(shù)量對(duì)比：76例占位組患者中，肺泡灌洗液中檢測到異常脫落細(xì)胞數(shù)為6.34±11.62個(gè),20例非占位組中，肺泡灌洗液中檢測到異常脫落細(xì)胞數(shù)為0.50±0.95個(gè)，兩組數(shù)據(jù)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。
　　3、占位組患者中良性占位與肺癌異常脫落細(xì)胞數(shù)量對(duì)比：76例占位組患者中，病理確

18、診肺癌56例，肺部良性占位20例。56例肺癌患者中，檢測到的異常脫落細(xì)胞數(shù)為8.18±13.04個(gè)，20例良性占位中，檢測到的異常脫落細(xì)胞數(shù)為1.20±1.67個(gè)，兩組數(shù)據(jù)之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。
　　4、良性占位患者與非占位組患者異常脫落細(xì)胞數(shù)量對(duì)比：20例良性占位中，檢測到的異常脫落細(xì)胞數(shù)為1.20±1.67個(gè)，20例非占位性病變患者中，檢測到的異常脫落細(xì)胞數(shù)為0.50±0.95個(gè)，兩組數(shù)據(jù)之間差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義

19、（P=0.231）。
　　5、CUT-OFF值計(jì)算：進(jìn)一步做ROC曲線分析，當(dāng)異常脫落細(xì)胞數(shù)大于等于2個(gè)時(shí)，患者為肺癌的可能性最大，曲線下面積（AUC）為0.864，P=0.000，95%置信區(qū)間為0.790-0.937，敏感度為80.4%，特異度為82.5%。
　　6、異常脫落細(xì)胞檢測與經(jīng)支氣管肺組織活檢（transbronchial lung biopsy,TBLB）結(jié)合對(duì)肺癌的診斷：76例患者中，確診肺癌56例，其中由

20、TBLB病理標(biāo)本確診46例，肺癌患者中經(jīng)支氣管鏡檢查診斷率為82.14%，結(jié)合支氣管鏡檢查及肺泡灌洗液異常脫落細(xì)胞檢查兩種方法，56例肺癌患者中可發(fā)現(xiàn)異常細(xì)胞的患者達(dá)到96.43%，與單獨(dú)使用支氣管鏡活檢相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P=0.032）。
　　7、CTCs檢測與異常脫落細(xì)胞檢測對(duì)比：
　　CTCs檢測中，占位組共213例，檢測到的陽性細(xì)胞均值為5.46±8.74個(gè)。異常脫落細(xì)胞檢測中，占位組76例，檢測到的陽性細(xì)胞均

21、值為6.34±11.62個(gè)，兩組之間統(tǒng)計(jì)學(xué)無差異（P=0.775）；
　　57例患者同時(shí)進(jìn)行了CTCs檢測與異常脫落細(xì)胞檢測，其中CTCs檢測陽性率為66.67%，異常脫落細(xì)胞檢測陽性率為63.16%，兩組之間統(tǒng)計(jì)學(xué)無差異（P=0.815）；
　　57例同時(shí)進(jìn)行CTCs檢測與異常脫落細(xì)胞檢測的患者中，病理確診肺癌有43例，該43例患者CTCs檢測陽性率為81.40%，異常脫落細(xì)胞檢測陽性率為74.42%，兩組之間統(tǒng)計(jì)學(xué)無差異

22、（P=0.607）。
　　CTCs檢測中，最終確診肺癌患者197例，該197例患者CTCs均值為5.78±8.98個(gè)。異常脫落細(xì)胞檢測中，最終病理確診肺癌患者56例，該56例患者異常脫落細(xì)胞均值為8.18±13.04個(gè)，兩組之間存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異（P=0.025）。
　　五、結(jié)論：TBLB結(jié)合支氣管肺泡灌洗液異常脫落細(xì)胞檢測可進(jìn)一步提高周圍型肺癌的診斷率。肺癌患者支氣管肺泡灌洗液脫落細(xì)胞檢測可得到較CTCs更多的陽性細(xì)胞，但兩種