NR2A抑制劑通過(guò)調(diào)控AQP4的表達(dá)抑制癲癇發(fā)作的研究.pdf

1、目的：
　　癲癇（Epilepsy, EP）是神經(jīng)系統(tǒng)常見疾病之一。癲癇發(fā)病機(jī)制至今仍不明確，這無(wú)疑給其治療帶來(lái)極大困惑，因此尋找新的靶點(diǎn)治療癲癇仍是當(dāng)今神經(jīng)科學(xué)研究者急需解決的問(wèn)題。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，N-甲基-D-天冬氨酸（N-mathy1-D-aspartate, NMDA）受體亞型NR2A抑制劑可下調(diào)P-糖蛋白的表達(dá)，抑制癲癇的發(fā)作；水通道蛋白4（Aquaporin4, AQP4）抑制劑乙酰唑胺，可抑制AQP4的表達(dá)，延

2、緩癲癇的發(fā)作；另有研究證實(shí)，NR2A可調(diào)控AQP4的表達(dá)。本研究通過(guò)檢測(cè)癲癇持續(xù)狀態(tài)（status epilepticus, SE）后不同時(shí)間點(diǎn)大鼠海馬組織AQP4的表達(dá)情況和海馬組織水含量的變化，同時(shí)在SE后AQP4表達(dá)的最高時(shí)間點(diǎn)，檢測(cè)NR2A抑制劑對(duì)海馬組織AQP4表達(dá)的影響，觀察腦水腫形成情況，從而探討NR2A抑制劑是否通過(guò)調(diào)控AQP4的表達(dá)而抑制癲癇的發(fā)作，目的是研究NR2A抑制劑抑制癲癇發(fā)作的作用機(jī)制，為尋找新靶點(diǎn)NR2A抑

3、制劑治療癲癇提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　將實(shí)驗(yàn)大鼠隨機(jī)分為6組：對(duì)照組（腹腔注射生理鹽水）、SE后0 h、12 h、24 h、48 h、72 h組（腹腔注射戊四氮致癇），通過(guò)Western blot、RT-qPCR檢測(cè)各組大鼠海馬組織中AQP4蛋白和mRNA的表達(dá)，免疫組織化學(xué)染色法檢測(cè)大鼠海馬組織中AQP4的表達(dá)和分布，采用干—濕重法檢測(cè)大鼠海馬組織中的水含量。通過(guò)上述實(shí)驗(yàn)，研究在戊四氮（pentylenetetraz

4、ol, PTZ）誘導(dǎo)的SE模型中AQP4以及海馬組織水含量在72 h內(nèi)的動(dòng)態(tài)表達(dá)變化，篩選出AQP4表達(dá)的最高時(shí)間點(diǎn)，為下一步實(shí)驗(yàn)提供依據(jù)。
　　將32只成年大鼠隨機(jī)分成4組：對(duì)照組（先側(cè)腦室注射生理鹽水，再腹腔給予生理鹽水）、致癇組（先側(cè)腦室給予等量生理鹽水，再腹腔注射PTZ）、PEAQX處理組（先側(cè)腦室注射PEAQX處理30 min，再腹腔注射PTZ）、PEAQX對(duì)照組（先側(cè)腦室注射PEAQX預(yù)處理30 min，再腹腔注射生理

5、鹽水）。在上述檢測(cè)的AQP4表達(dá)的最高時(shí)間點(diǎn)，觀察每組大鼠行為學(xué)表現(xiàn)，并使用BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄各組大鼠腦電的變化，Western blot和RT-qPCR檢測(cè)AQP4蛋白和mRNA的表達(dá)，干—濕重法檢測(cè)每組大鼠海馬組織中水含量的變化。
　　結(jié)果：
　　Western blot、RT-qPCR結(jié)果：致癇組大鼠海馬組織中AQP4蛋白和mRNA的表達(dá)從12 h開始增加，24 h達(dá)到高峰與對(duì)照組相比明顯升高（P<0.0

6、5），持續(xù)至48 h后降低，至72 h時(shí)其含量仍比對(duì)照組高（P<0.05）；免疫組織化學(xué)染色結(jié)果：光學(xué)顯微鏡下可見AQP4主要表達(dá)在海馬組織CA3區(qū)，不同時(shí)間點(diǎn)的免疫反應(yīng)強(qiáng)弱不一，對(duì)照組及SE0 h組雖然可見陽(yáng)性物質(zhì)，但顆粒染色淺，分布稀疏， SE12 h組、SE24h組觀察到CA3區(qū)AQP4免疫反應(yīng)逐步增強(qiáng)，陽(yáng)性著色細(xì)胞數(shù)量逐步增加， SE24 h組達(dá)到高峰，明顯強(qiáng)于對(duì)照組（P<0.05），到SE48 h組、SE72h組免疫反應(yīng)逐漸減

7、弱，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量減少，但仍高于對(duì)照組（P<0.05）；干—濕重法結(jié)果：對(duì)照組大鼠腦組織水含量為[（83.067±1.534）％]，SE后12 h組大鼠腦水含量開始增加，至24 h大鼠腦水含量為[（89.967±2.500）％]明顯高于對(duì)照組（P<0.05），持續(xù)至48 h后降低，至72 h時(shí)大鼠腦中含水量為[（87.833±2.567）％]仍比對(duì)照組高（P<0.05）。通過(guò)側(cè)腦室注射PEAQX后，行為學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)對(duì)照組、PEAQX對(duì)照組無(wú)

8、癇性發(fā)作，致癇組癲癇發(fā)作明顯且迅速，PEAQX干預(yù)組明顯延長(zhǎng)了PTZ致癲癇的潛伏期，降低了癲癇發(fā)作級(jí)別；腦電圖結(jié)果：對(duì)照組、PEAQX對(duì)照組沒有明顯癲癇波，致癇組記錄到多個(gè)棘波或棘—慢綜合波等癲癇波，PEAQX干預(yù)組癲癇波減少；Western blot、RT-qPCR結(jié)果發(fā)現(xiàn)致癇組AQP4蛋白和mRNA表達(dá)明顯增加，與對(duì)照組相比差異顯著（ P<0.05）， PEAQX干預(yù)組與致癇組比較發(fā)現(xiàn)AQP4表達(dá)降低（P<0.05），但仍高于對(duì)照組