基于新一代測序技術(shù)的生后小鼠卵巢發(fā)育過程中基因表達(dá)譜變化的研究.pdf

1、卵巢是雌性哺乳動物的生殖器官，具有產(chǎn)生成熟卵泡、分泌雌性激素等重要功能。卵巢發(fā)育是復(fù)雜的組織發(fā)生過程，其關(guān)鍵分子事件包括原始卵泡形成、原始卵泡啟動募集和優(yōu)勢卵泡選擇等。但迄今為止，卵巢發(fā)育的分子機(jī)制和調(diào)控機(jī)理尚未被完全闡明?；诨蛐酒穆殉不虮磉_(dá)譜研究可以揭示不同階段卵巢組織中表達(dá)的基因及其表達(dá)水平，從而為分子水平研究卵巢發(fā)育調(diào)控機(jī)制提供了理論基礎(chǔ)。然而，常規(guī)基因芯片技術(shù)存在成本昂貴、檢測靈敏度低、重復(fù)性差、分析泛圍窄等缺點(diǎn)。這使得

2、卵巢基因表達(dá)譜研究只能限定在中高表達(dá)豐度的既有基因模型，且不能鑒定表達(dá)基因的可變剪切體，從而無法全面剖析卵巢組織基因表達(dá)譜。
　　 近3年來，基于新一代測序技術(shù)的基因表達(dá)譜研究(RNA-seq)成為轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究領(lǐng)域的熱點(diǎn)。大量針對模式生物的RNA-seq研究表明：與傳統(tǒng)芯片技術(shù)相比，RNA-seq能在全基因組范圍內(nèi)以單堿基分辨率檢測和量化轉(zhuǎn)錄本，具有信噪比高、分辨率高、應(yīng)用范圍廣等優(yōu)勢，已經(jīng)成為轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究的重要實(shí)驗(yàn)手段。在本研

3、究中，我們采用新一代測序技術(shù)(SOLiD)對小鼠卵巢發(fā)育的三個代表性時期（幼年期，1周齡；青春期，4周齡；成年期，8周齡）的卵巢組織進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究，以全面了解在這三個關(guān)鍵時期卵巢組織中基因的表達(dá)變化情況。
　　 我們對小鼠三個時期卵巢的轉(zhuǎn)錄組文庫利用新一代測序儀SOLiD進(jìn)行了測序，并將測序所得到的序列比對到小鼠基因組上，然后參照Ensemble基因注釋模型對序列進(jìn)行了注釋。在三個樣本中，我們分別得到了12，585，638、1

4、5，652，548和17，476，893條序列專一比對到小鼠基因組上，其中專一比對到基因外顯子區(qū)域的序列數(shù)分別為：1，987，750、1，919，665和5，128，962條。我們以外顯子區(qū)域?qū)Ｒ槐葘π蛄袛?shù)大于等于2作為基因表達(dá)的標(biāo)準(zhǔn)，分別鑒定出16，961、17，185和18，632個基因在幼年期、青春期和成年期小鼠卵巢中表達(dá)，比基因芯片方法多檢測出50％基因。基因可變剪切分析發(fā)現(xiàn)，在卵巢組織中有6，692個基因具有可變剪切形式，共發(fā)

5、現(xiàn)5002種與Ensemble注釋模型不同的可變剪切形式，并且發(fā)現(xiàn)一些基因的不同可變剪切體在不同發(fā)育時期的特異性表達(dá)。
　　 我們采用RPKM值衡量基因表達(dá)豐度以歸一化三個文庫基因表達(dá)譜，并進(jìn)行了三個不同時期卵巢基因表達(dá)譜的聚類分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)幼年期和青春期的小鼠卵巢基因表達(dá)譜聚為一類，這一結(jié)果與三個發(fā)育時期的小鼠卵巢生理特征相一致。研究表明，卵泡發(fā)育過程按照其對促性腺激素的依賴性可以被分為兩個階段，第一個階段為腔前卵泡階段，該階

6、段的發(fā)育不依賴于促性腺激素；第二個階段為有腔卵泡發(fā)育階段，必須依靠促性腺激素的刺激才能發(fā)育至成熟卵泡。青春期和幼年期小鼠的卵巢中以第一個發(fā)育階段的卵泡為主，而成年小鼠卵巢內(nèi)則含有大量的有腔卵泡。因此，青春期小鼠卵巢的基因表達(dá)譜與幼年期小鼠卵巢表達(dá)譜更為相似的聚類結(jié)果很好地呈現(xiàn)了這一點(diǎn)。
　　 三個時期基因差異表達(dá)分析表明，434個基因在青春期小鼠卵巢與幼年期小鼠卵巢中存在顯著差異表達(dá)，成年小鼠和青春期小鼠卵巢之間差異表達(dá)基因個數(shù)

7、為4,366個。三個發(fā)育時期差異表達(dá)基因數(shù)目的差異進(jìn)一步驗(yàn)證了三個時期基因表達(dá)譜聚類分析結(jié)果。在青春期小鼠與成年期小鼠的4，366個差異表達(dá)基因中，有4,100個基因表現(xiàn)為在成年期小鼠中表達(dá)豐度的上調(diào)。這表明成年期小鼠卵巢內(nèi)基因表達(dá)較前面兩個時期更為活躍。這些上調(diào)的基因涉及到多個生物學(xué)功能的調(diào)控，例如激素合成、能量代謝、細(xì)胞組成、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞凋亡調(diào)控。另外，我們發(fā)現(xiàn)類固醇激素合成相關(guān)基因(Cypllal、Hsd17bl、Hsd3bl)

8、的轉(zhuǎn)錄活力在小鼠卵巢發(fā)育過程中持續(xù)上調(diào)。
　　 我們共發(fā)現(xiàn)了1，535個轉(zhuǎn)錄因子在三個時期小鼠卵巢中表達(dá)，這其中既有已被證明在卵巢發(fā)育過程中起重要作用的轉(zhuǎn)錄因子例如：Nr5al、Emx2、Nobox、Fox12、Sox3等，也有大量的在卵巢發(fā)育過程中功能未知的轉(zhuǎn)錄因子。另外，我們研究發(fā)現(xiàn)了561個低表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子(RPKM<1)，已有研究表明一些低表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子例如Figla、Lhx9和Sox3等在小鼠卵巢發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用

9、。這些低表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子較難被芯片方法檢測到，它們的發(fā)現(xiàn)可以使我們更深入地了解小鼠卵巢轉(zhuǎn)錄組。另外，我們的數(shù)據(jù)同時發(fā)現(xiàn)了大量的non-codingRNA參與了卵巢的發(fā)育調(diào)控，并且可能發(fā)揮了比較重要的作用。在三個文庫中共檢測到1110個表達(dá)的non-coding RNA，包括snoRNA、snRNA、miRNA和miscP,NA。已有報(bào)道的在卵巢中表達(dá)的non-coding RNA基因例如mir-199a、mir-let7a、mir-let