茴拉西坦改善阿爾茨海默病小鼠認(rèn)知功能和增強(qiáng)突觸可塑性的機(jī)制探討.pdf

1、目的：阿爾茨海默?。ˋlzheimer disease，AD）是最常見的老年期癡呆類型，其臨床特征表現(xiàn)為隱襲起病，進(jìn)行性的記憶和認(rèn)知功能減退，多伴有人格、精神異常，是年齡相關(guān)的神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病；病理學(xué)特征表現(xiàn)為β-淀粉樣蛋白（β-amyloid， Aβ）沉積于神經(jīng)元外形成大量老年斑（Senile plaques，SP）和神經(jīng)元內(nèi)形成以過度磷酸化的微管相關(guān)蛋白tau為主要成分的神經(jīng)原纖維纏結(jié)（Neurofibrillary tangle

2、s，NFTs），同時伴有膽堿能神經(jīng)元數(shù)量、突觸數(shù)量的明顯減少。迄今為止，AD的發(fā)病機(jī)制仍不是十分明確，當(dāng)前國內(nèi)外醫(yī)學(xué)界主要有以下幾種學(xué)說：膽堿能神經(jīng)損傷學(xué)說、線粒體損傷學(xué)說、氧化應(yīng)激學(xué)說、遺傳與基因突變學(xué)說等，但目前無一學(xué)說能闡明其發(fā)病機(jī)制。東莨菪堿（scopolamine, SCO）是M型膽堿受體拮抗劑，可阻斷大腦皮層和海馬區(qū)乙酰膽堿對M受體的激動作用，從而對記憶獲得產(chǎn)生阻抑效應(yīng)，誘導(dǎo)癡呆，已經(jīng)被廣泛應(yīng)用在神經(jīng)營養(yǎng)藥物的評估上。腹腔給

3、藥3mg/Kg后可造成動物記憶功能障礙。東莨菪堿用于誘導(dǎo)動物記憶障礙模型具有簡單、經(jīng)濟(jì)、方便等優(yōu)點，故常應(yīng)用于抗AD活性化合物的初步篩選。茴拉西坦（aniracetam）作為γ-氨基丁酸的環(huán)化衍生物，為腦代謝增強(qiáng)藥，對于改善抑郁癥患者的癥狀方面具有長期效果，同時，茴拉西坦還有抗焦慮的作用。其主要作用機(jī)制可能是通過調(diào)節(jié)谷氨酸受體中的AMPA受體和類乙酰膽堿能系統(tǒng)，但國內(nèi)尚未見將茴拉西坦應(yīng)用東莨菪堿致癡呆模型中，本實驗以東莨菪堿致癡呆作為A

4、D的模型，探討AMPA受體（GluR1）、突觸可塑性蛋白的表達(dá)情況，并探討茴拉西坦是否可以通過激活谷氨酸受體磷酸化和增高突觸蛋白的表達(dá)來改善AD小鼠的認(rèn)知功能。
　　方法：
　　SPF級雄性BALB/c小鼠96只，全部動物購自北京華維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于河北省人民醫(yī)院臨床研究中心動物室內(nèi)。由動物中心的飼養(yǎng)員管理，以標(biāo)準(zhǔn)的鼠糧及純凈的飲水飼養(yǎng)。將小鼠隨機(jī)分為6組：vehicle組（生理鹽水3mg/kg，vehic

5、le group）、模型組（SCO3mg/kg， SCO group）、低劑量組（SCO3mg/kg+茴拉西坦40mg/kg，L-A group）、中劑量組（SCO3mg/kg+茴拉西坦80mg/kg，M-A group）、高劑量組（SCO3mg/kg+茴拉西坦160mg/kg，H-A group）、石杉堿甲組（SCO3mg/kg+石杉堿甲0.15mg/kg，Huper-A group），每組16只，SCO皮下注射日一次，連續(xù)給藥60天

6、，茴拉西坦和石杉堿甲在第50天灌胃給藥，均為日一次，連續(xù)給藥10天。造模完成后進(jìn)行新物體識別實驗，實驗完成取小鼠海馬組織，采用Western blot蛋白分析法測定ERK1/2、p-ERK1/2、GluR1、p-GluR1Ser845、PSD-95、SYN在海馬組織蛋白表達(dá)量；采用 RT-qPCR技術(shù)測定ERK1/2、GluR1、PSD-95、SYN的mRNA表達(dá)量。采用免疫組化方法測定海馬組織PSD-95、SYN的陽性細(xì)胞數(shù)。采用專用

7、試劑盒檢測乙酰膽堿酯酶活性。
　　結(jié)果：
　　1.茴拉西坦改善東莨菪堿引起的小鼠認(rèn)知功能下降
　　與vehicle組相比，SCO組小鼠的認(rèn)知指數(shù)明顯降低（P<0.01），這說明東莨菪堿明顯降低了小鼠的認(rèn)知功能，造模成功。而經(jīng)茴拉西坦治療后，與SCO組相比，M-A和H-A組小鼠認(rèn)知指數(shù)均顯著升高（P<0.01），說明茴拉西坦可以改善小鼠的認(rèn)知功能。
　　2.茴拉西坦對突觸可塑性相關(guān)蛋白的影響
　　2.1.茴拉

8、西坦激活東莨菪堿小鼠海馬ERK1/2蛋白表達(dá)磷酸化
　　6組之間的ERK1/2蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）；與vehicle組相比， SCO組小鼠海馬組織p-ERK1/2蛋白表達(dá)明顯下降（P<0.01），說明造模成功；而經(jīng)茴拉西坦治療后，與SCO組相比，M-A和H-A組海馬p-ERK1/2蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）；陽性對照組蛋白水平p-ERK1/2表達(dá)明顯升高（P<0.01）。
　　2.2.茴拉

9、西坦激活東莨菪堿小鼠海馬GluR1蛋白表達(dá)磷酸化
　　6組之間的GluR1蛋白表達(dá)水平?jīng)]有明顯統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）；與vehicle組相比， SCO組小鼠海馬組織 p-GluR1蛋白表達(dá)明顯下降（P<0.01），說明造模成功；而經(jīng)茴拉西坦治療后，與SCO組相比，H-A組海馬p-GluR1蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.01）；陽性對照組蛋白水平p-GluR1表達(dá)明顯升高（P<0.01）。
　　2.3.茴拉西坦減輕東莨菪堿

10、小鼠海馬突觸蛋白PSD-95、SYN表達(dá)的改變
　　與vehicle組相比，SCO組小鼠海馬組織PSD-95、SYN蛋白表達(dá)明顯下降（P<0.01，P<0.01）；而經(jīng)茴拉西坦治療后，與SCO組相比，L-A組海馬PSD-95、SYN蛋白水平均顯著升高（P<0.01，P<0.01）；陽性對照組PSD-95、SYN蛋白水平表達(dá)明顯升高（P<0.01，P<0.01）。免疫組織化學(xué)染色后可見蛋白表達(dá)水平的變化主要是在海馬CA1區(qū)。

11、　　3.茴拉西坦上調(diào)東莨菪堿小鼠海馬ERK1/2、GluR1、SYN、PSD-95基因的表達(dá)
　　與vehicle組相比，SCO組小鼠海馬組織ERK1/2、GluR1、SYN、PSD-95基因表達(dá)均明顯下降（P<0.01）,而經(jīng)茴拉西坦治療后，與SCO組相比， M-A和H-A組海馬ERK1/2基因水平均顯著升高（P<0.05, P<0.01）；與SCO組相比，H-A組海馬GluR1基因水平均顯著升高（P<0.01）；與SCO組相比

12、， L-A組海馬PSD-95、SYN基因水平均即顯著升高（P<0.01、P<0.01），陽性對照組基因水平相應(yīng)基因表達(dá)均明顯升高（P<0.01）。
　　4.乙酰膽堿酯酶活性測定結(jié)果
　　與vehicle組相比，石杉堿甲組乙酰膽堿酯酶活性明顯下降（P<0.01），而 SCO組乙酰膽堿酯酶活性與 vehicle組相比差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），同樣，茴拉西坦治療組對于乙酰膽堿酯酶活性的影響也沒有統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）