食管鱗狀細(xì)胞癌患者Bin1基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)及其在食管癌發(fā)生發(fā)展中的作用.pdf

1、第一部分：食管鱗狀細(xì)胞癌患者Bin1基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)及其意義
　　目的：通過(guò)檢測(cè)橋接整合因子-1（bridging integrator-1, Bin1）基因在食管鱗癌（esophageal squamous cell cancer, ESCC）患者癌組織和其癌旁組織中表達(dá)情況及其啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，分析在ESCC患者中Bin1甲基化狀態(tài)與其表達(dá)及臨床病理特征的關(guān)系，探討 Bin1基因甲基化在 ESCC臨床中的意義，為Bin1基

2、因甲基化作為新靶點(diǎn)應(yīng)用于ESCC綜合治療提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.收集2014年6月至2015年6月期間河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院胸外科手術(shù)切除的58例ESCC患者的癌組織和癌旁組織，并將每例標(biāo)本分為3份，其中2份標(biāo)本取下后迅速置于液氮罐中，后放置于-80℃超低溫冰箱中貯存以備提取RNA、DNA時(shí)使用；另1份以4％甲醛溶液固定以備制作蠟塊時(shí)使用，用于免疫組織化學(xué)。
　　2.采用免疫組織化學(xué)法（immunohisto

3、chemistry, IHC）、甲基化特異性PCR（Methylation-Specific polymerase Chain Reaction, MSP）、實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（Quantitative Real-time PCR, qRT-PCR）分別檢測(cè)58例經(jīng)病理證實(shí)的ESCC患者的癌組織、癌旁組織中Bin1蛋白的表達(dá)情況、Bin1基因的表達(dá)情況和Bin1基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)，分析ESCC中Bin1甲基化狀態(tài)與Bin1蛋白

4、、基因表達(dá)情況及與患者臨床病理特征之間的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.在58例食管鱗癌患者中，ESCC組織中Bin1蛋白低表達(dá)發(fā)生率明顯高于相應(yīng)癌旁組織[37/58(63.79%) vs.13/58(22.41%), P<0.01]；在58例ESCC患者中，ESCC組織中Bin1 mRNA的表達(dá)水平明顯低于癌旁組織，分別為（0.78±0.05）vs.（1.03±0.03）（t=9.643, P<0.01）；Bin1發(fā)生甲基化的

5、組織中Bin1 mRNA表達(dá)水平顯著低于未發(fā)生甲基化的組織，分別為（0.68±0.04）vs.（0.85±0.07）（t=2.476, P<0.05），Bin1基因呈低表達(dá)的患者有35例，是Bin1蛋白低表達(dá)的患者的94.59%。這一結(jié)果提示，在ESCC組織中Bin1在基因水平和蛋白水平的表達(dá)一致。
　　2.在35例Bin1 mRNA呈低表達(dá)的ESCC組織中有32例（91.43%） Bin1基因啟動(dòng)子發(fā)生甲基化，在37例Bin1蛋

6、白呈低表達(dá)的ESCC組織中有33例（89.19%）Bin1基因啟動(dòng)子發(fā)生甲基化；說(shuō)明在 ESCC組織中Bin1啟動(dòng)子區(qū)的異常甲基化與Bin1的低表達(dá)相關(guān)，且Bin1甲基化是Bin1在ESCC組織中低表達(dá)的原因之一。
　　3.Bin1甲基化狀態(tài)與患者TNM分期、腫瘤侵犯深度、分化程度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（P<0.05），與患者年齡、性別比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。
　　結(jié)論：食管癌患者腫瘤組織中Bin1呈高甲基化狀態(tài)，Bin

7、1高甲基化狀態(tài)與食管癌患者腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期等臨床病理特征密切相關(guān)。
　　第二部分： Bin1基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)在食管鱗癌發(fā)生發(fā)展中的作用
　　目的：通過(guò)檢測(cè)ESCC細(xì)胞YES-2、TE13、TE1、KYSE30和EC109中Bin1表達(dá)情況和甲基化狀態(tài)，選擇YES-2和TE13細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)，應(yīng)用去甲基化藥物5-氮雜-2’脫氧胞苷（5-Aza-2’ deoxycytidine,5-Aza-d

8、C）作用于YES-2和 TE13細(xì)胞，分析去甲基化前后 Bin1表達(dá)水平、ESCC細(xì)胞增殖、凋亡等惡性生物學(xué)行為和 EMT相關(guān)蛋白的變化，探討 Bin1在 ESCC發(fā)生發(fā)展的可能機(jī)制，為 Bin1基因甲基化作為新靶點(diǎn)應(yīng)用于ESCC綜合治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：
　　1.分別采用 qRT-PCR、MSP方法檢測(cè) Bin1在5種人食管鱗癌細(xì)胞YES-2、TE13、TE1、KYSE30和EC109中的表達(dá)情況及甲基化狀態(tài)，選出

9、 YES-2和 TE13進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。使用去甲基化藥物5-Aza-dC對(duì)兩種ESCC細(xì)胞進(jìn)行干預(yù)，并分別用MSP、Western-blot對(duì)兩種ESCC細(xì)胞進(jìn)行檢測(cè)，分析Bin1甲基化狀態(tài)與其表達(dá)的變化情況。
　　2.采用MTT、克隆形成實(shí)驗(yàn)、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)YES-2和TE13細(xì)胞去甲基化前后增殖能力的改變情況，分析Bin1甲基化對(duì)ESCC細(xì)胞增殖能力的影響。
　　3.采用流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry assay

10、, FCM）檢測(cè)YES-2和TE13細(xì)胞去甲基化前后增殖、凋亡能力的改變情況，分析Bin1甲基化對(duì)ESCC細(xì)胞增殖、凋亡能力的影響。
　　4.采用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)、Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)YES-2和TE13細(xì)胞去甲基化前后遷移、侵襲能力的改變情況，分析Bin1甲基化對(duì)ESCC細(xì)胞遷移、侵襲能力的影響。
　　5.采用Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)YES-2和TE13細(xì)胞去甲基化前后上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（Epithelial-Mese

11、nchymal Transition, EMT）相關(guān)蛋白E鈣粘蛋白（E-cadherin, E-cad）、N鈣粘蛋白（N-cadherin, N-cad）、基質(zhì)金屬蛋白酶2（Matrix Metalloproteinase-2, MMP-2）、基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP-9）等表達(dá)的改變情況，探討B(tài)in1甲基化影響ESCC細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生情況。
　　結(jié)果：
　　1.Bin1 mRNA在TE13、TE1、KYSE30、E

12、C109和YES-2五種ESCC細(xì)胞中均呈低表達(dá)狀態(tài)（P<0.01）；五種ESCC細(xì)胞均為甲基化狀態(tài)，其中YES-2和TE1兩種細(xì)胞為完全甲基化狀態(tài)；經(jīng)5-Aza-dC去甲基化處理后，YES-2、TE13、TE1為非甲基化狀態(tài)；篩選出YES-2和TE13細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)；經(jīng)5-Aza-dC去甲基化處理后YES-2和TE13兩種人ESCC細(xì)胞Bin1蛋白表達(dá)提高（P<0.01）。
　　2.MTT結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度（30μM、60μ

13、M、90μM）5-Aza-dC干預(yù)YES-2細(xì)胞后d2天，細(xì)胞的增殖抑制率分別為6.7±0.9%、12.3±1.7%和15.4±2.1%，培養(yǎng) d7天時(shí)，細(xì)胞的增長(zhǎng)抑制率分別為7.3±1.0%、49.3±5.7%和59.6±6.3%，與濃度為0μM的對(duì)照組相比，細(xì)胞增殖率顯著降低；經(jīng)不同濃度（30μM、60μM、90μM）的5-Aza-dC干預(yù)TE13細(xì)胞后d2天，細(xì)胞的增殖抑制率分別為6.4±0.8%、11.9±1.7%和15.1±2

14、.0%，培養(yǎng) d7天時(shí)，細(xì)胞的增長(zhǎng)抑制率分別為7.0±1.1%、47.2±5.6%和57.2±5.9%，與濃度為0μM的對(duì)照組相比，細(xì)胞增殖率顯著降低（P<0.01）?？寺⌒纬蓪?shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：經(jīng)不同濃度（0μM、30μM、60μM、90μM）5-Aza-dC干預(yù)YES-2細(xì)胞后，細(xì)胞的克隆數(shù)分別為（233±29）、（189±23）、（105±16）和（71±11）,與濃度為0μM的對(duì)照組相比，克隆數(shù)明顯降低；經(jīng)不同濃度（0μM、30μM、

15、60μM、90μM）5-Aza-dC干預(yù) TE13細(xì)胞后，細(xì)胞的克隆數(shù)分別為（281±33）、（235±28）、（139±19）和（83±12），與濃度為0μM的對(duì)照組相比，克隆數(shù)明顯降低。說(shuō)明YES-2和TE13細(xì)胞經(jīng)去甲基化處理后增殖活性均顯著下降（P<0.01）。
　　3.流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度（0μM、30μM、60μM、90μM）5-Aza-dC干預(yù) YES-2細(xì)胞后，細(xì)胞處于G0/G1期的百分比分別為：（37.

16、2±3.1）%、（46.5±3.9）%、（58.2±4.3）%和（70.7±4.9）%，處于S期的百分比分別為：（50.6±4.2）%、（42.7±3.6）%、（26.6±3.1）%和（20.5±2.4）%，與濃度為0μM的對(duì)照組相比，細(xì)胞處于G0/G1期的百分比明顯升高，處于S期的百分比明顯降低；經(jīng)不同濃度（0μM、30μM、60μM、90μM）5-Aza-dC干預(yù)TE13細(xì)胞后，細(xì)胞處于G0/G1期的百分比分別為：（33.7±2.8

17、）%、（39.4±3.6）%、（47.3±3.9）%和（56.3±4.5）%，處于S期的百分比分別為：（70.2±4.5）%、（58.3±4.2）%、（45.2±3.1）%和（32.6±2.8）%，與濃度為0μM的對(duì)照組相比，細(xì)胞處于G0/G1期的百分比明顯升高，處于S期的百分比明顯降低。說(shuō)明經(jīng)去甲基化處理后， ESCC細(xì)胞周期發(fā)生改變，處于S期的細(xì)胞顯著下降，阻滯于G0/G1期的細(xì)胞顯著上升（P<0.01）。
　　流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果

18、顯示，經(jīng)不同濃度（0μM、30μM、60μM、90μM）5-Aza-dC干預(yù)YES-2細(xì)胞后，處于凋亡的細(xì)胞百分比為：（4.12±0.89）%、（7.49±1.34）%、（10.03±2.13）%和（13.07±2.47），與濃度為0μM的對(duì)照組相比，處于凋亡的細(xì)胞百分比明顯提高（P<0.01）；經(jīng)不同濃度（0μM、30μM、60μM、90μM）的5-Aza-dC干預(yù)TE13細(xì)胞后，處于凋亡的細(xì)胞百分比為：（3.57±0.78）%、（8

19、.09±1.43）%和（10.15±2.08）%、（15.64±2.55），與濃度為0μM的對(duì)照組相比，處于凋亡的細(xì)胞百分比明顯提高（P<0.01）。
　　上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明Bin1基因去甲基化后可以抑制YES-2和TE13細(xì)胞的增殖能力和促進(jìn)其凋亡，對(duì)于ESCC細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為具有抑制作用。
　　4.劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：發(fā)現(xiàn)經(jīng)5-Aza-dC去甲基化處理后，YES-2細(xì)胞的48h遷移距離為（57.7±4.5）μm，未經(jīng)去甲

20、基化處理的48h遷移距離為（122.4±9.4）μm，去甲基化處理后的YES-2細(xì)胞遷移距離明顯短于處理前，其結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）；TE13細(xì)胞經(jīng)5-Aza-dC去甲基化處理后的48h遷移距離為（64.2±4.8）μm，未經(jīng)去甲基化處理的48h遷移距離為（133.4±8.1）μm，去甲基化處理后的TE13細(xì)胞遷移距離明顯短于處理前，其結(jié)果具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.01）。YES-2和 TE13細(xì)胞遷移距離顯著縮短，說(shuō)明Bin

21、1經(jīng)去甲基化處理后能夠抑制YES-2和TE13細(xì)胞的遷移能力。
　　Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，經(jīng)不同濃度（0μM、30μM、60μM、90μM）的5-Aza-dC去甲基化處理后的YES-2細(xì)胞，穿過(guò)Matrigel濾膜的細(xì)胞數(shù)分別為（206±35）、（137±29）、（78±18）和（39±9），與濃度為0μM的對(duì)照組相比，穿過(guò)Matrigel濾膜細(xì)胞術(shù)明顯減少（P<0.01）。經(jīng)不同濃度（0μM、30μM、60μM、90μ

22、M）的5-Aza-dC去甲基化處理后的TE13細(xì)胞，穿過(guò)Matrigel濾膜的細(xì)胞數(shù)分別為（289±42）、（145±33）、（57±16）和（48±12），與濃度為0μM的對(duì)照組相比，穿過(guò) Matrigel濾膜細(xì)胞術(shù)明顯減少（P<0.01）。YES-2和TE13細(xì)胞穿膜細(xì)胞數(shù)顯著減少，說(shuō)明Bin1經(jīng)去甲基化處理后能夠抑制兩種細(xì)胞的侵襲能力。
　　上述實(shí)驗(yàn)說(shuō)明說(shuō)明Bin1經(jīng)去甲基化后能夠抑制YES-2和TE13細(xì)胞的遷移、侵襲能力

23、。
　　5.Western blot檢測(cè)結(jié)果顯示：ESCC細(xì)胞YES-2和TE13經(jīng)5-Aza-dC處理后，EMT相關(guān)蛋白E-cad表達(dá)上調(diào)（P<0.01），N-cad、Snail、MMP-2和MMP-9蛋白的表達(dá)下調(diào)（P<0.01），說(shuō)明Bin1去甲基化處理后能夠改變YES-2和TE13細(xì)胞EMT相關(guān)蛋白的表達(dá)從而抑制上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的發(fā)生。
　　結(jié)論：體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)Bin1甲基化影響食管癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移和侵襲能力，通過(guò)抑