EZH2在侵襲性垂體腺瘤中蛋白質(zhì)和mRNA表達(dá)的臨床病理研究.pdf

1、目的：
　　EZH2是polycomb repressive complex2復(fù)合體中具有催化功能的亞基，主要功能為抑制催化組蛋白27位賴氨酸的三甲基轉(zhuǎn)移。在多種人類腫瘤中已經(jīng)證實(shí)了基因突變導(dǎo)致的EZH2高表達(dá)和調(diào)節(jié)功能失調(diào)，同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)EZH2在人類腫瘤中與腫瘤細(xì)胞的惡性轉(zhuǎn)化、增殖、侵襲和腫瘤干細(xì)胞化密切相關(guān)。然而在人類垂體腺瘤組織中EZH2的表達(dá)情況目前仍未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了EZH2蛋白質(zhì)和mRNA在垂體腺瘤中的表達(dá)水平，同

2、時(shí)比較其在侵襲性垂體瘤和非侵襲性垂體腺瘤中的表達(dá)差異，并探討EZH2蛋白質(zhì)與MT1-MMP蛋白質(zhì)以及垂體腺瘤患者年齡、性別、腫瘤大小和激素類型等臨床病理因子間的相互關(guān)系。
　　方法：
　　本研究臨床及病理資料取自山東省立醫(yī)院神經(jīng)外科在2006年7月至2015年9月接受手術(shù)治療并術(shù)后病理學(xué)診斷為垂體腺瘤的62例患者（男性30例，女性32例），平均年齡為42.0±10.2歲?；颊卟v資料和影像學(xué)資料均保存齊全。該研究所有包含病例

3、獲得患者或家屬的知情同意，并簽訂知情使用同意書(shū)。
　　根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行免疫組織化學(xué)檢測(cè)EZH2、Ki-67和MT1-MMP的表達(dá)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果評(píng)價(jià)根據(jù)光鏡高倍視野(400×)下計(jì)數(shù)腫瘤細(xì)胞及呈現(xiàn)棕黃色或者棕褐色顆粒的陽(yáng)性腫瘤細(xì)胞，得出陽(yáng)性細(xì)胞占腫瘤細(xì)胞總數(shù)的百分率，無(wú)陽(yáng)性細(xì)胞記為表達(dá)陰性(-);＜10％為弱陽(yáng)性(+);10％～50％為中等陽(yáng)性(++);≥50％為強(qiáng)陽(yáng)性(+++)。一個(gè)標(biāo)本的綜合得分取該標(biāo)本5個(gè)視野的染色得分

4、均值。
　　根據(jù)說(shuō)明書(shū)分別進(jìn)行總RNA提取、cDNA文庫(kù)的制備和PCR反應(yīng)，檢測(cè)EZH2的mRNA表達(dá)量，并以β-actin作為內(nèi)參，計(jì)算EZH2基因mRNA的相對(duì)表達(dá)量。利用student t test分析侵襲性垂體腺瘤和非侵襲性垂體腺瘤中EZH2mRNA表達(dá)水平的差異。
　　根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)流程（濕轉(zhuǎn)）進(jìn)行western blot反應(yīng)，檢測(cè)EZH2蛋白質(zhì)的相對(duì)表達(dá)量，內(nèi)參蛋白采用β-actin。利用student t test分

5、析侵襲性垂體腺瘤和非侵襲性垂體腺瘤中EZH2蛋白質(zhì)表達(dá)水平的差異。
　　所有統(tǒng)計(jì)學(xué)圖片處理通過(guò)Photoshop CC和Graphpad Prism6.0進(jìn)行。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理利用SPSS20.0軟件進(jìn)行。
　　結(jié)果：
　　1.免疫組織化學(xué)檢測(cè)EZH2蛋白和MT1-MMP在垂體腺瘤組織病理石蠟切片中的表達(dá)及其與臨床病理因素間的相關(guān)關(guān)系
　　免疫組織化學(xué)檢測(cè)顯示EZH2蛋白在垂體腺瘤組織中主要為細(xì)胞核染色，并伴有部分細(xì)胞

6、質(zhì)著色。EZH2蛋白在垂體腺瘤組織中表達(dá)的總陽(yáng)性率高達(dá)88.7％(55/62)，其中侵襲性垂體腺瘤中陽(yáng)性率為100％(30/30)，非侵襲性垂體腺瘤為78.1％(25/32)。根據(jù)體積分類，大腺瘤中EZH2陽(yáng)性率為93.6％(44/47)，小腺瘤為73.3％（包括微腺瘤11/15）。Spearman rank correlation test結(jié)果顯示EZH2蛋白在侵襲性垂體瘤中的表達(dá)強(qiáng)度顯著高于非侵襲性垂體瘤(P=0.008)，同時(shí)在大

7、腺瘤中的表達(dá)強(qiáng)度顯著高于小腺瘤(P=0.018)。但是，EZH2蛋白與垂體腺瘤患者的性別(P=0.439)、年齡(P=0.694)和分泌激素類型(P=0.416)之間未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。ANOVA分析結(jié)果顯示，Ki-67在EZH2不同表達(dá)強(qiáng)度間其大小差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.001)。Dunnet T3兩兩分析顯示，Ki-67在EZH2陰性與所有陽(yáng)性組別間均存在差異(P分別=0023，0.002和0.004)，在陽(yáng)性組別間，弱陽(yáng)性組小于

8、強(qiáng)陽(yáng)性組(P=0.024)，但是弱陽(yáng)性組和中度陽(yáng)性組間(P=0.293)以及中度陽(yáng)性組和強(qiáng)陽(yáng)性組間(P=0.238)無(wú)明顯差異。
　　MT1-MMP蛋白在垂體腺瘤組織中主要為細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜著色。MT1-MMP蛋白在垂體腺瘤中的表達(dá)總陽(yáng)性率為80.6％(50/62)。MT1-MMP蛋白質(zhì)在侵襲性垂體腺瘤(86.7％，26/30)中的表達(dá)率高于非侵襲性垂體腺瘤75％(24/32)。MT1-MMP的表達(dá)強(qiáng)度與EZH2表達(dá)強(qiáng)度密切相關(guān)(P

9、=0.002)。另外，MT1-MMP蛋白表達(dá)強(qiáng)度在侵襲性垂體腺瘤中大于非侵襲性垂體腺瘤(P=0.009)。但是，MT1-MMP與垂體腺瘤患者的性別(P=0.186)、年齡(P=0.652)、腫瘤體積(P=0.631)以及分泌激素類型(P=0.859)之間的相關(guān)性未發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。另外，Ki-67在不同MT1-MMP分組間無(wú)明顯表達(dá)差異(P＞0.05)。
　　2.PCR和western blot檢測(cè)新鮮冰凍組織中EZH2mRNA和蛋

10、白質(zhì)的表達(dá)差異
　　EZH2mRNA表達(dá)水平在侵襲性垂體腺瘤中高于非侵襲性垂體腺瘤(6.07倍，P＜0.001);EZH2蛋白質(zhì)表達(dá)水平在侵襲性垂體腺瘤中高于非侵襲性垂體腺瘤（3.61倍，P＜0.001）。
　　結(jié)論：
　　1.EZH2和MT1-MMP在垂體腺瘤中高頻率表達(dá)。
　　2.EZH2和MT1-MMP與人類垂體腺瘤的侵襲性生物學(xué)行為密切相關(guān)，在侵襲性垂體腺瘤中的表達(dá)強(qiáng)度高于非侵襲性垂體腺瘤。EZH2同時(shí)與