膀胱癌患者體內(nèi)粘膜相關(guān)恒定T細(xì)胞(MAIT)的數(shù)量、功能及其抗腫瘤作用研究.pdf

1、背景及目的：
　　膀胱癌(bladder cancer,BC)是泌尿系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤之一，嚴(yán)重威脅患者的生命健康，近十多年來中國膀胱癌發(fā)病率和死亡率有所上升。膀胱癌，特別是肌浸潤性膀胱癌的治療效果，目前仍不理想，多數(shù)患者在接受了手術(shù)、放療、化療等的綜合治療后，仍出現(xiàn)局部復(fù)發(fā)或遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移，最終死于膀胱癌。免疫治療，作為繼手術(shù)、化療、放療之后的第四種腫瘤治療手段，正日益成熟而受到人們的關(guān)注。隨著研究的不斷深入，部分新型的膀胱癌免疫治

2、療已經(jīng)在小規(guī)模臨床試驗(yàn)中取得了較好的療效。
　　腫瘤的免疫治療是通過免疫學(xué)的方法，提高腫瘤細(xì)胞的免疫原性和其對(duì)效應(yīng)細(xì)胞殺傷作用的敏感性，激發(fā)和增強(qiáng)人體抗腫瘤免疫應(yīng)答，和/或同時(shí)向人體內(nèi)輸注免疫細(xì)胞和/或免疫效應(yīng)分子，協(xié)同人體的免疫系統(tǒng)，從而到達(dá)殺傷腫瘤細(xì)胞，和/或抑制腫瘤生長的目的。因此，充分地了解人體的免疫系統(tǒng)，包括免疫細(xì)胞、免疫效應(yīng)分子及其相互作用，特別是了解腫瘤患者的免疫系統(tǒng)，是提高腫瘤免疫治療效果的重要基礎(chǔ)。
　　粘

3、膜相關(guān)恒定T細(xì)胞（MAIT細(xì)胞）是一類表達(dá)半恒定T細(xì)胞受體的天然樣T細(xì)胞，最先在腸道粘膜中發(fā)現(xiàn)，故提出了“粘膜相關(guān)的”概念。MAIT細(xì)胞在人類T細(xì)胞中占比豐富，在器官與組織中分布廣泛，其活化后可產(chǎn)生多種細(xì)胞因子及細(xì)胞毒性產(chǎn)物，從而產(chǎn)生免疫效應(yīng)。有研究表明MAIT細(xì)胞與人類細(xì)菌性感染、病毒性感染及炎癥性疾病等存在密切關(guān)系，MAIT細(xì)胞具有明顯的抗菌作用，但同時(shí)可能導(dǎo)致自身免疫性疾病患者粘膜免疫失調(diào)。已有少量研究發(fā)現(xiàn)MAIT細(xì)胞與結(jié)直腸癌、

4、胃癌、肺癌等腫瘤相關(guān)，在結(jié)直腸癌組織中MAIT細(xì)胞數(shù)量增加，分泌的IFN-γ細(xì)胞因子卻減少，而結(jié)直腸癌患者外周血的MAIT細(xì)胞無明顯變化或顯著減少，MAIT細(xì)胞可誘發(fā)結(jié)腸癌細(xì)胞系G2期阻滯現(xiàn)象，可能具有潛在的腫瘤免疫監(jiān)視作用?？傊?，MAIT細(xì)胞是否具有抗腫瘤作用仍不明確，不同的研究結(jié)論也存在相互矛盾之處，提示MAIT細(xì)胞可能具有雙向作用。雖然MAIT細(xì)胞與人類腫瘤之間有著密切的關(guān)系，但目前國內(nèi)外尚無MAIT細(xì)胞在膀胱癌中的研究，為此通過

5、流式細(xì)胞術(shù)和體外體內(nèi)試驗(yàn)，研究BC患者體內(nèi)MAIT細(xì)胞的數(shù)量、功能及其抗腫瘤作用。
　　方法：
　　1、本研究共入選初診“膀胱癌”患者75例，健康志愿者183人，所有參與者均排除感染性疾病、自身免疫性疾病、其他腫瘤性疾病及可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果而不確定的既往病史，并簽署知情同意書。術(shù)后病理確診膀胱癌的64例患者最終納入統(tǒng)計(jì)分析。收集BC患者或健康對(duì)照者空腹靜脈血，采用密度梯度離心法分離提取外周血單個(gè)核細(xì)胞，加入相應(yīng)熒光標(biāo)記抗體避光

6、孵育后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血MAIT細(xì)胞數(shù)量;或通過加入刺激劑PMA/Ionomycin及蛋白轉(zhuǎn)運(yùn)阻斷劑GolgiPlug刺激孵育后，流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血分泌IFN-γ、TNF-α、IL-2及IL-17的MAIT細(xì)胞比例，以確定MAIT細(xì)胞功能。根治性膀胱全切除術(shù)切除的新鮮膀胱癌組織標(biāo)本，由手術(shù)醫(yī)生剔除壞死組織后，經(jīng)酶消化獲取單細(xì)胞懸液，再離心獲取單個(gè)核細(xì)胞，加入相應(yīng)熒光標(biāo)記抗體避光孵育，流式細(xì)胞儀檢測(cè)膀胱組織癌浸潤的MAIT細(xì)胞數(shù)量。

7、
　　2、收集BC患者的臨床腫瘤特征，包括手術(shù)中發(fā)現(xiàn)的膀胱腫瘤大小、腫瘤數(shù)目，按照WHO2004分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)確定的組織學(xué)分級(jí)，及國際抗癌聯(lián)盟第七版TNM分期法確定的腫瘤浸潤性，將膀胱腫瘤患者外周血MAIT細(xì)胞數(shù)量與功能按臨床腫瘤特征進(jìn)行分層分析。
　　3、構(gòu)建pLVX-EF1a-Luc2/GFP-IRES-Puro質(zhì)粒，制備Luc2/GFP慢病毒載體，滴度測(cè)定后，感染人膀胱癌細(xì)胞株T24，制備表達(dá)Luc2/GFP的T24細(xì)胞株，

8、分別通過免疫熒光技術(shù)和生物發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)GFP表達(dá)及熒光素酶活性，最終構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)Luc2/GFP的T24細(xì)胞株及細(xì)胞殺傷檢測(cè)平臺(tái)。流式分選并體外擴(kuò)增獲得MAIT細(xì)胞后，與T24-Luc2/GFP細(xì)胞按不同的效靶比共培養(yǎng)，同時(shí)設(shè)置PBMC對(duì)照組，通過生物發(fā)光成像系統(tǒng)檢測(cè)MAIT細(xì)胞體外殺傷效果。收集MAIT細(xì)胞體外培養(yǎng)后的培養(yǎng)基上清液加入T24-Luc2/GFP細(xì)胞，觀察其對(duì)T24細(xì)胞生長的影響。通過皮下注射T24-Luc2/GFP細(xì)

9、胞，構(gòu)建基于活體成像技術(shù)的異種移植膀胱癌模型，再在腫瘤部位局部注射MAIT細(xì)胞，活體動(dòng)物成像系統(tǒng)檢測(cè)腫瘤大小變化。
　　結(jié)果：
　　1、外周血MAIT細(xì)胞廣泛存在于從青年到老年的健康人群中，其約占CD3+T細(xì)胞的1.26％（中位值;范圍區(qū)間:0.10％-7.87％，下同），其絕對(duì)數(shù)為2.33×104/ml(0.15-14.55×104ml)，隨著年齡的增長，MAIT細(xì)胞占CD3+T細(xì)胞的比例及其絕對(duì)數(shù)量都呈顯著下降。按年齡分

10、層后，在青年組（20-40歲）、中年組(40-60歲)和老年組（60歲以上）之間，健康人群外周血MAIT細(xì)胞占CD3+T細(xì)胞比例及其絕對(duì)數(shù)均存在顯著差異(p＜0.01)。相關(guān)性分析發(fā)現(xiàn)健康人外周血MAIT細(xì)胞占CD3+T細(xì)胞比例與年齡呈負(fù)相關(guān)(r=-0.345，p＜0.001)。
　　BC患者外周血中MAIT細(xì)胞占CD3+T細(xì)胞比例為1.05％（0.10％-5.70％），其絕對(duì)數(shù)量為0.92×104/ml(0.12-3.07×10

11、4ml)，與其年齡性別相匹配的健康對(duì)照者之間無顯著差異。亞群分析發(fā)現(xiàn)，BC患者外周血中MAIT細(xì)胞以CD8+亞群為主（72.35％，10.4％-90.0％），少量CD4+亞群(5.74％，0.55％-16.0％)，與健康對(duì)照者比較無明顯差異。在8例根治性膀胱切除術(shù)患者的膀胱癌組織內(nèi)，均存在MAIT細(xì)胞，約占CD45+CD3+細(xì)胞的1.99％（1.01％-5.75％）。
　　BC患者外周血MAIT細(xì)胞功能研究發(fā)現(xiàn)，分泌IFN-γ的M

12、AIT細(xì)胞比例顯著高于健康人群（中位數(shù):65.65％vs29.75％，p＜0.0001）;分泌TNF-α的MAIT細(xì)胞比例顯著高于健康人群(65.85％vs28.52％，p＜0.001);分泌IL-2的MAIT細(xì)胞比例顯著高于健康人群(13.10％vs4.41％，p＜0.0001);BC患者外周血中分泌IL-17的MAIT細(xì)胞與健康人群無明顯差異(0.86％vs0.88％，p＞0.05)。
　　2、進(jìn)一步分層分析顯示，BC患者外周

13、血中MAIT細(xì)胞的數(shù)量在不同腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤浸潤性之間無明顯差異。BC患者外周血中分泌IFN-γ的MAIT細(xì)胞比例與腫瘤數(shù)目相關(guān)（腫瘤多發(fā)組vs腫瘤單發(fā)組:72.65％vs61.70％，p＜0.05，中位數(shù)，下同），與腫瘤浸潤性相關(guān)（浸潤性膀胱癌組vs非浸潤性膀胱癌組:73.10％vs62.50％，p＜0.05），與腫瘤大小可能存在相關(guān)性（腫瘤最大徑D≥3cm組vs最大徑D＜3cm組:72.30％vs64.60％，p

14、=0.1216），與腫瘤組織學(xué)分級(jí)無明顯相關(guān)性。BC患者外周血中分泌TNF-α、IL-2、IL-17的MAIT細(xì)胞比例在不同腫瘤大小、腫瘤數(shù)目、組織學(xué)分級(jí)、腫瘤浸潤性之間無明顯差異。
　　3、成功構(gòu)建pLVX-EF1a-Luc2/GFP-IRES-Puro質(zhì)粒，成功制備Luc2/GFP慢病毒載體，并感染獲得穩(wěn)定表達(dá)Luc2/GFP的人膀胱癌細(xì)胞株T24，通過化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)儀驗(yàn)證該細(xì)胞株熒光信號(hào)的強(qiáng)弱與細(xì)胞數(shù)呈線性正相關(guān)，熒光強(qiáng)度可穩(wěn)

15、定持續(xù)1-1.5h，即成功建立了表達(dá)Luc2/GFP的T24細(xì)胞株及細(xì)胞殺傷檢測(cè)平臺(tái)。MAIT細(xì)胞與T24-Luc2/GFP細(xì)胞共培養(yǎng)結(jié)果表明，隨著效靶比的增高，靶細(xì)胞殺傷效率提高，當(dāng)效靶比(Effector:Target)為20∶1和40∶1時(shí)，MAIT細(xì)胞的殺傷效率顯著優(yōu)于同等數(shù)量的PBMC(p＜0.05、p＜0.01)。MAIT細(xì)胞體外培養(yǎng)后的培養(yǎng)基上清與T24-Luc2/GFP細(xì)胞的共培養(yǎng)顯示，隨著MAIT細(xì)胞培養(yǎng)基上清液比例的

16、升高，T24-Luc2/GFP生長逐漸受到抑制，當(dāng)上清液與新鮮培養(yǎng)基比例為1∶1、1∶2、1∶4時(shí)，與對(duì)照組相比具有顯著差異(p＜0.01，p＜0.05，p＜0.05)體內(nèi)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，腫瘤部位局部注射MAIT細(xì)胞可顯著縮小腫瘤大小，具有顯著差異(p＜0.05)。
　　結(jié)論：
　　1、本研究發(fā)現(xiàn)正常成年人群外周血MAIT細(xì)胞數(shù)量與年齡成負(fù)相關(guān);與年齡性別相匹配的正常人群相比，BC患者外周血MAIT細(xì)胞數(shù)量無顯著變化，而膀胱癌