LRH-1在尼羅羅非魚雌激素生成和卵子發(fā)生中的作用.pdf

1、肝受體同系物-1（liver receptor homolog-1, LRH-1, NR5A2），隸屬于核受體NR（nuclear receptor）5A亞家族，是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子。LRH-1的結(jié)構(gòu)在脊椎動物中十分保守。其在機(jī)體代謝、發(fā)育、膽汁酸動態(tài)平衡和類固醇生成中起著重要的作用。
　　LRH-1在垂體、腎上腺、脂肪、胰腺、肝臟、腸道、精巢、卵巢等器官中表達(dá)。在哺乳動物中，LRH-1主要表達(dá)在各發(fā)育階段卵巢的濾泡顆粒細(xì)胞（Gr

2、anulosa cells）和黃體細(xì)胞中，在鞘膜細(xì)胞（Theca cells）中沒有表達(dá)；在精巢生殖細(xì)胞和萊氏細(xì)胞（Leydig cells）中有表達(dá)，在支持細(xì)胞（Sertoli cells）中沒有表達(dá)。在小鼠中，LRH-1純合敲除致死。雜合突變雄鼠的附睪和精囊體重比正常小鼠低，Star、Scc、3β-HSD等類固醇生成因子表達(dá)含量下降；雜合突變LRH-1雌鼠由于Star、Cyp19a1等類固醇基因表達(dá)水平降低而導(dǎo)致小鼠不能排卵。顆粒細(xì)

3、胞特異性條件敲除LRH-1雌鼠不育，不能排卵。在硬骨魚類中，利用RT-PCR的方法證實(shí)了LRH-1在腦、垂體、鰓絲、鰾、肝臟、腸道、脂肪、血液、卵巢以及腎臟和頭腎中均有表達(dá)。在石斑魚中，LRH-1表達(dá)在卵巢的濾泡細(xì)胞和生殖細(xì)胞中。有體外實(shí)驗(yàn)證明LRH-1可以結(jié)合在cyp19a1a和cyp19a1b的啟動子上并激活它們的表達(dá)。在脊椎動物中，至今沒有LRH-1在小鼠以外的功能研究報(bào)道，也沒有對羅非魚LRH-1的表達(dá)和功能進(jìn)行系統(tǒng)的研究報(bào)道。

4、
　　在本研究中，利用RT-PCR，Western blot以及免疫組織化學(xué)方法研究了LRH-1在羅非魚不同組織和雌雄性腺不同發(fā)育階段中的表達(dá)以及細(xì)胞定位；并利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對尼羅羅非魚中的LRH-1進(jìn)行突變，獲得了F0代陽性魚和F1代雜合子，進(jìn)一步研究了LRH-1在性腺中的作用。研究結(jié)果如下：
　　通過中山大學(xué)張為民教授實(shí)驗(yàn)室獲得斑點(diǎn)石斑魚LRH-1抗體，利用ClustalX軟件對用于制作石斑魚LRH-1多克

5、隆抗體的抗原氨基酸序列（172-288）和羅非魚肝受體同系物-1（liver receptor homolog-1, LRH-1, NR5A2），隸屬于核受體NR（nuclear receptor）5A亞家族，是一種重要的轉(zhuǎn)錄因子。LRH-1的結(jié)構(gòu)在脊椎動物中十分保守。其在機(jī)體代謝、發(fā)育、膽汁酸動態(tài)平衡和類固醇生成中起著重要的作用。
　　LRH-1在垂體、腎上腺、脂肪、胰腺、肝臟、腸道、精巢、卵巢等器官中表達(dá)。在哺乳動物中，LRH

6、-1主要表達(dá)在各發(fā)育階段卵巢的濾泡顆粒細(xì)胞（Granulosa cells）和黃體細(xì)胞中，在鞘膜細(xì)胞（Theca cells）中沒有表達(dá)；在精巢生殖細(xì)胞和萊氏細(xì)胞（Leydig cells）中有表達(dá)，在支持細(xì)胞（Sertoli cells）中沒有表達(dá)。在小鼠中，LRH-1純合敲除致死。雜合突變雄鼠的附睪和精囊體重比正常小鼠低，Star、Scc、3β-HSD等類固醇生成因子表達(dá)含量下降；雜合突變LRH-1雌鼠由于Star、Cyp19a1等

7、類固醇基因表達(dá)水平降低而導(dǎo)致小鼠不能排卵。顆粒細(xì)胞特異性條件敲除LRH-1雌鼠不育，不能排卵。在硬骨魚類中，利用RT-PCR的方法證實(shí)了LRH-1在腦、垂體、鰓絲、鰾、肝臟、腸道、脂肪、血液、卵巢以及腎臟和頭腎中均有表達(dá)。在石斑魚中，LRH-1表達(dá)在卵巢的濾泡細(xì)胞和生殖細(xì)胞中。有體外實(shí)驗(yàn)證明LRH-1可以結(jié)合在cyp19a1a和cyp19a1b的啟動子上并激活它們的表達(dá)。在脊椎動物中，至今沒有LRH-1在小鼠以外的功能研究報(bào)道，也沒有對

8、羅非魚LRH-1的表達(dá)和功能進(jìn)行系統(tǒng)的研究報(bào)道。
　　在本研究中，利用RT-PCR，Western blot以及免疫組織化學(xué)方法研究了LRH-1在羅非魚不同組織和雌雄性腺不同發(fā)育階段中的表達(dá)以及細(xì)胞定位；并利用CRISPR/Cas9系統(tǒng)對尼羅羅非魚中的LRH-1進(jìn)行突變，獲得了F0代陽性魚和F1代雜合子，進(jìn)一步研究了LRH-1在性腺中的作用。研究結(jié)果如下：
　　通過中山大學(xué)張為民教授實(shí)驗(yàn)室獲得斑點(diǎn)石斑魚LRH-1抗體，利用C

9、lustalX軟件對用于制作石斑魚LRH-1多克隆抗體的抗原氨基酸序列（172-288）和羅非魚的LRH-1相應(yīng)蛋白氨基酸序列進(jìn)行比對，發(fā)現(xiàn)石斑魚抗原部分98％的氨基酸序列都可以比對到羅非魚的蛋白氨基酸序列上。證明石斑魚的LRH-1抗體可以用來檢測羅非魚的LRH-1蛋白。我們通過Western blot結(jié)果顯示：石斑魚的LRH-1多克隆抗體能特異識別羅非魚的LRH-1天然蛋白（85 kDa），并發(fā)現(xiàn)LRH-1在羅非魚的精巢、卵巢中均有一

10、條主帶，且在心臟、腦、肝臟中表達(dá)。RT-PCR結(jié)果顯示LRH-1可在羅非魚腦、鰓絲、心臟、脾、肝臟、腸、卵巢、精巢、肌肉等組織中表達(dá)。此外，免疫組化結(jié)果顯示：LRH-1主要表達(dá)在早期生殖細(xì)胞和類固醇生成細(xì)胞，在卵巢中表達(dá)于卵原細(xì)胞、卵母細(xì)胞、間質(zhì)細(xì)胞和鞘膜細(xì)胞，在精巢中表達(dá)于精原細(xì)胞、精母細(xì)胞和萊氏細(xì)胞。且LRH-1與Cyp19a1a/Cyp17a1/Cyp17a2共表達(dá)于卵巢的間質(zhì)細(xì)胞和鞘膜細(xì)胞。LRH-1和Sf-1表達(dá)模式基本一致。

11、
　　利用CRISPR/Cas9技術(shù)在尼羅羅非魚突變LRH-1基因，獲得F0代XX與XY的陽性魚，尾鰭突變率最高為98%，最低為50%。對F0代陽性魚分析表明：與對照XX雌魚相比，120 dah時(shí)，XX陽性魚卵巢出現(xiàn)空腔，且Cyp19a1a/cyp19a1a、scc、starI表達(dá)下調(diào)。同時(shí)，通過EIA檢測顯示，XX陽性魚雌激素水平下調(diào)；210 dah時(shí)，XX陽性魚卵巢相比對照組卵巢表現(xiàn)為發(fā)育延遲，卵巢中還保留大量類固醇陽性細(xì)胞。

12、通過LRH-1突變的陽性F0代XY雄魚與野生型XX雌魚雜交產(chǎn)生F1代雜合子LRH-1+/-。性腺組織檢測結(jié)果表明，與對照雌魚相比，在90 dah LRH-1+/-XX雌魚卵巢中，間質(zhì)細(xì)胞減少，Cyp19a1a/cyp19a1a表達(dá)下調(diào)，雌激素水平下調(diào)。在210 dah LRH-1+/-XX雌魚卵巢中，卵子發(fā)育延遲，有大量卵母細(xì)胞停留在I、II時(shí)相，遲遲不能積累卵黃，且有空腔出現(xiàn)，卵巢性腺成熟系數(shù)（GSI）顯著降低；與對照XY雄魚相比，9

13、0 dah時(shí)，LRH-1+/-XY雄魚精巢內(nèi)部結(jié)構(gòu)紊亂，但在180 dah時(shí)精巢內(nèi)部恢復(fù)正常，產(chǎn)生的精子可育。精巢芳香化酶Cyp19a1b/cyp19a1b表達(dá)下調(diào)，雌激素水平下調(diào)，雄激素水平?jīng)]有顯著變化。由于F1代雌魚不育，所以嘗試用兩種方法建立LRH-1純合突變魚，第一種方法為用F0代LRH-1突變雌魚和F0代突變雄魚雜交，嘗試在雜交后代中篩選純合子；第二種方法為用F0代突變雌魚和F1代突變雄魚雜交，嘗試在雜交后代中篩選純合子，但酶