活體成像監(jiān)測(cè)納米金激活肝臟SAA及SAA促進(jìn)T細(xì)胞遷移作用研究.pdf

1、背景：
　　隨著納米科技的迅猛發(fā)展，納米尺度材料在生物醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越廣泛，納米顆粒對(duì)環(huán)境以及人類健康的影響逐漸引起人們關(guān)注。納米材料的理化性質(zhì)是決定其在生物體內(nèi)命運(yùn)的基礎(chǔ)，如形貌、粒徑、表面化學(xué)等，直接決定其與體內(nèi)循環(huán)系統(tǒng)和吞噬性細(xì)胞作用的方式和代謝途徑。肝臟是人體中重要的解毒器官，也是納米材料在人體內(nèi)的主要蓄積地點(diǎn)之一，因此，充分評(píng)估納米顆粒暴露后以肝臟炎性反應(yīng)為首的不良反應(yīng)是至關(guān)重要的。然而，目前無(wú)論是臨床還是實(shí)驗(yàn)室均缺

2、乏明確的、具有高靈敏度和高認(rèn)可度的生物學(xué)指標(biāo)用于評(píng)估和指示納米藥物、納米佐劑或納米造影劑暴露后，肝臟炎癥細(xì)胞、炎性介質(zhì)以及所發(fā)生的急性免疫反應(yīng)之間的復(fù)雜相互作用。血清淀粉樣蛋白A（SAA）是一種非常靈敏的急性時(shí)相反應(yīng)蛋白，肝臟是急性時(shí)相反應(yīng)期間合成SAA的主要場(chǎng)所。已有研究嘗試將SAA、C反應(yīng)蛋白（C-reactive protein，CRP）聯(lián)合觸珠蛋白（haptoglobin，HP）作為生物標(biāo)志物進(jìn)行二氧化硅納米材料暴露毒性的預(yù)測(cè)。

3、那么，可否將SAA作為一種靈敏、可靠的生物學(xué)指標(biāo)用來(lái)評(píng)估和篩選應(yīng)用廣泛的系列納米金材料，并探究其引起的急性毒性與其粒徑形貌之間的關(guān)聯(lián)呢？
　　SAA除了可能作為一種靈敏的納米肝毒性生物標(biāo)志物之外，也具有一定的免疫調(diào)節(jié)作用。已有報(bào)道表明，急性炎癥期間，循環(huán)系統(tǒng)中升高的SAA作用于單核巨噬細(xì)胞，促進(jìn)其分泌系列趨化因子，從而招募更多的白細(xì)胞到炎癥部位。那么SAA在體內(nèi)是否能夠調(diào)控T細(xì)胞的遷移和歸巢，增強(qiáng)CTL細(xì)胞的殺傷功能，并增強(qiáng)其抗腫

4、瘤作用效果呢？為回答上述科學(xué)問(wèn)題，我們開展本論文的研究工作。
　　目的：
　　針對(duì)SAA可能作為一種靈敏、可靠的納米肝毒性生物學(xué)標(biāo)志物及其在機(jī)體炎癥免疫調(diào)節(jié)中的作用效果，本研究旨在探討SAA是否能夠作為評(píng)價(jià)納米金暴露引起肝臟急性炎癥反應(yīng)的生物學(xué)指標(biāo)，并闡明涉及其中的炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)和信號(hào)通路的相關(guān)機(jī)制；同時(shí)探索SAA對(duì)過(guò)繼性T細(xì)胞在體內(nèi)趨化及遷移歸巢的調(diào)控作用，并闡明其相關(guān)機(jī)制。
　　方法及結(jié)果：
　　（1）SAA-

5、Luc小鼠模型和STAT3-Luc小鼠模型的建立及驗(yàn)證。應(yīng)用水動(dòng)力高壓轉(zhuǎn)染技術(shù)結(jié)合密碼子優(yōu)化的噬菌體整合酶體系，將SAA和STAT3的報(bào)告基因質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到小鼠肝臟，并且整合到小鼠染色體中，通過(guò)活體熒光成像系統(tǒng)，實(shí)現(xiàn)對(duì)上述功能蛋白的實(shí)時(shí)、動(dòng)態(tài)、無(wú)創(chuàng)監(jiān)測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在相同刺激水平的情況下，通過(guò)小鼠模型得到的結(jié)果與采用傳統(tǒng)蛋白檢測(cè)方法得到的結(jié)果基本吻合。同時(shí)，由于引入了噬菌體整合酶體系，能夠?qū)崿F(xiàn)報(bào)告基因在肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞中的長(zhǎng)時(shí)間穩(wěn)定表達(dá)，建模90天

6、后的SAA-Luc小鼠模型依然能夠?qū)χ嗵牵↙ipopolysaccharide，LPS）產(chǎn)生強(qiáng)烈且迅速的響應(yīng)。說(shuō)明肝臟 SAA及STAT3可視化小鼠模型構(gòu)建成功，并且上述小鼠模型尤其適合于對(duì)肝臟功能蛋白進(jìn)行長(zhǎng)期的動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)。
　?。?）納米金因形貌和粒徑的不同激活的肝臟SAA表達(dá)有明顯差異。采用可視化SAA-Luc小鼠模型評(píng)價(jià)了6種不同形貌和粒徑納米金的肝臟急性炎癥反應(yīng)，其激活肝臟 SAA表達(dá)的強(qiáng)弱順序?yàn)椋篏NS50>GNS30>

7、GNS10>GNCs>GNRs>GNS80，其中處于臨界尺度的粒徑約50nm的球形納米金相比其他尺寸及形貌材料能夠引起更強(qiáng)的肝臟急性炎癥反應(yīng)。上述結(jié)果同時(shí)說(shuō)明，在相同表面修飾情況下，肝區(qū)細(xì)胞攝取納米材料的途徑和引起肝臟炎癥反應(yīng)的程度由納米粒子的幾何形狀、尺度及其在生物體內(nèi)的分布共同決定。在所考察的尺度范圍內(nèi)，球型納米金引起肝臟急性炎癥的強(qiáng)弱具有尺度依賴性，但是該影響非線性相關(guān)。
　?。?）SAA-Luc小鼠模型對(duì)納米金刺激的響應(yīng)更

8、靈敏。在0.02、0.1、0.5和2.5 mg/kg的GNS50暴露劑量下分別使用SAA-Luc小鼠模型和ELISA檢測(cè)SAA的表達(dá)量。結(jié)果表明，0.1mg/kg的GNS50暴露后應(yīng)用小鼠模型能夠監(jiān)測(cè)到SAA的表達(dá)，其峰值熒光強(qiáng)度為基礎(chǔ)值的5倍左右，而此時(shí)ELISA已經(jīng)檢測(cè)不到血清中SAA濃度的變化。同時(shí)發(fā)現(xiàn)在2.5 mg/kg的GNS50暴露下應(yīng)用SAA-Luc小鼠模型檢測(cè)到的SAA表達(dá)峰值時(shí)間早于通過(guò)ELISA得到的結(jié)果（4h vs

9、.12h）。上述結(jié)果說(shuō)明基于活體熒光成像技術(shù)的SAA-Luc小鼠模型相較于ELISA等血清學(xué)檢測(cè)方法不僅更靈敏，而且可以實(shí)現(xiàn)對(duì)納米暴露的早期預(yù)警。
　?。?）納米金暴露后誘導(dǎo)肝臟Kupffer細(xì)胞M1極化，分泌系列促炎因子，啟動(dòng)SAA表達(dá)。ELISA檢測(cè)了GNS50暴露后2h內(nèi)肝臟研磨液中IL-1β、IL-6和TNF-α的含量。結(jié)果表明，這些促炎因子在納米金暴露后1h即明顯升高。隨后使用SAA-Luc小鼠模型動(dòng)態(tài)評(píng)價(jià)了GNS50暴

10、露后1h到2h之間SAA的激活，發(fā)現(xiàn)從80min后開始能夠監(jiān)測(cè)到小鼠肝臟SAA的表達(dá)，晚于肝臟促炎因子升高的時(shí)間。分別注射IL-1β、IL-6或TNF-α到小鼠體內(nèi)均能明顯激活SAA表達(dá)。為探究這些細(xì)胞因子的來(lái)源，我們檢測(cè)了納米金暴露后肝臟Kupffer細(xì)胞和骨髓來(lái)源巨噬細(xì)胞表型的變化。結(jié)果表明，納米金能夠誘導(dǎo)肝臟Kupffer細(xì)胞M1極化，極化后的巨噬細(xì)胞能夠分泌大量IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子。將肝臟Kupffer細(xì)胞

11、去除以檢測(cè)Kupffer是否是SAA激活早期肝臟中促炎因子的主要來(lái)源。結(jié)果表明，受Kupffer細(xì)胞去除的影響，肝臟促炎因子早期分泌受到明顯抑制，肝臟SAA的表達(dá)明顯滯后。上述結(jié)果表明納米金暴露后隨血液循環(huán)系統(tǒng)進(jìn)入肝區(qū)，首先與肝臟Kupffer細(xì)胞相互作用，誘導(dǎo)其發(fā)生M1極化，分泌系列促炎因子，啟動(dòng)SAA表達(dá)。
　　（5）納米金通過(guò)NF-κB信號(hào)通路激活肝臟SAA表達(dá)。通過(guò)NF-κB-Luc小鼠模型和STAT3-Luc小鼠模型，結(jié)

12、合EMSA和Western Blot等方法，證明了GNS50能夠激活肝臟NF-κB和STAT3信號(hào)通路。使用NF-κB抑制劑PDTC能夠明顯抑制SAA的表達(dá)，但是在使用STAT3信號(hào)通路的抑制劑ASD1480和Cryptotanshinone后SAA的表達(dá)卻沒有受到明顯的抑制。這些結(jié)果說(shuō)明納米金誘導(dǎo)的肝臟SAA表達(dá)經(jīng)由NF-κB信號(hào)通路。
　?。?）SAA調(diào)控過(guò)繼性T細(xì)胞的遷移和歸巢。SAA瘤內(nèi)注射后，能夠明顯提高過(guò)繼性CD8+T

13、細(xì)胞對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。進(jìn)一步的機(jī)制研究結(jié)果表明，SAA能夠誘導(dǎo)腫瘤相關(guān)巨噬細(xì)胞發(fā)生M1再極化，分泌IL-1β、IL-6和TNF-α等促炎因子以及CCL3、CCL5和CXCL9等趨化因子，逆轉(zhuǎn)腫瘤微環(huán)境的免疫抑制狀態(tài)，促進(jìn)過(guò)繼性CD8+T細(xì)胞向腫瘤部位趨化，從而增強(qiáng)其對(duì)腫瘤生長(zhǎng)的抑制作用。
　　結(jié)論：
　　通過(guò)水動(dòng)力高壓轉(zhuǎn)染結(jié)合密碼子優(yōu)化的噬菌體整合酶系統(tǒng)構(gòu)建成了SAA-Luc和STAT3-Luc小鼠模型，能夠?qū)崟r(shí)、動(dòng)態(tài)、