抗微生物藥長期給藥對小鼠腸道微生物組多樣性的影響.pdf

1、人體內(nèi)有兩個基因組，一個是由父母遺傳得到的人體基因組，另一個則是出生以后才進入人體、尤其是腸道內(nèi)的共生微生物，稱為“人體第二基因組”。兩個基因組相互協(xié)調(diào)，維持人體的健康。腸道菌群不僅協(xié)助宿主攝取營養(yǎng)物質(zhì)和能量，在病原體抵抗和免疫調(diào)節(jié)方面也起著重要的作用?？股乜赡芨蓴_人體的各種生理功能，引起急性或慢性疾病。早期，傳統(tǒng)研究方法分辨率低以及成本高昂，大大地限制了研究者對抗生素干擾腸道微生物的認識。隨著高通量深度測序技術(shù)的發(fā)展以及新的微生物種

2、系聚類方法的建立，突破了傳統(tǒng)方法的瓶頸，揭示了腸道菌群的“罕見生物圈”。
　　 本課題組前期建立了通過Illumina雙末端測序16S rRNA標簽序列分析微生物群落的新方法(BIPES)，并建立了新的序列聚類工具TSC，可以高效低成本地分析微生物群落。
　　 通過連續(xù)15天灌胃給藥的方式比較黃連素、環(huán)丙沙星和甲硝唑三種用于治療感染性腹瀉的抗微生物藥物對小鼠腸道微生物組多樣性的影響，并闡述三種抗微生物藥物對小鼠腸道菌群的

3、作用特點。同時，以連續(xù)20天灌胃給藥的方式，通過Illumina高通量測序技術(shù)分析阿奇霉素和羅紅霉素對小鼠腸道微生物組多樣性的影響，比較阿奇霉素和羅紅霉素對小鼠腸道菌群作用的異同。
　　 目的:
　　 1、通過連續(xù)15天灌胃給藥的方式比較用于治療感染性腹瀉的黃連素、環(huán)丙沙星和甲硝唑三種抗微生物藥物對小鼠正常腸道微生物組多樣性的影響，闡述三者對小鼠腸道菌群的作用特點，為黃連素、環(huán)丙沙星和甲硝唑?qū)δc道細菌影響及臨床用藥等研究

4、提供一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。
　　 2、通過連續(xù)20天灌胃給藥，比較阿奇霉素和羅紅霉素對小鼠正常腸道菌群α和β多樣性的影響，為羅紅霉素和阿奇霉素的臨床用藥和腸道副作用研究提供一定的數(shù)據(jù)基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1、實驗一
　　 將32只雄性BALB/C小鼠隨機分為4組（8只/組），保證每組小鼠的體重分布相一致，即黃連素組(BBR)、環(huán)丙沙星組(CIP)、甲硝唑組(MNZ)和對照組(CK)。本實驗分為四個時期，分

5、別是給藥前期Ⅰ（3天）、灌胃期Ⅱ(5天)、給藥期Ⅲ（15天）和停藥期Ⅳ(40天)。黃連素組(BBR)，小鼠給藥劑量為0.100g每千克體重。環(huán)丙沙星組(CIP)，小鼠給藥劑量為0.072g每千克體重。甲硝唑組(MNZ)，小鼠給藥劑量為0.216g每千克體重。對照組(CK)，灌胃0.20毫升ddH2O。四組的灌胃頻率為每天上午灌胃一次。所有糞便樣品在灌胃前收集。對所收集的糞便樣品，每管稱取出10mg，加入50-65μl的去離子水，采用煮沸

6、法提取總DNA。針對所有糞便樣品的16S rRNA V6區(qū)進行PCR擴增。把PCR產(chǎn)物進行Illumina測序前，首先，用凝膠分析軟件BandScan進行相對定量，確定不同組別每個樣品PCR產(chǎn)物的加入量，然后，將包括標準品在內(nèi)的所有PCR產(chǎn)物，并按組別混合。其次，對各組樣品的混合PCR產(chǎn)物用Invitrogen熒光定量儀進行絕對定量，最后，根據(jù)各組別樣品PCR產(chǎn)物的絕對定量和計劃測序深度對各組PCR產(chǎn)物進行混合，并加入4個標準品，作為外

7、標樣品，以評估高通量深度測序的誤差。然后，將總PCR產(chǎn)物經(jīng)Illumina HiSeq2000測序儀進行PE100-bp測序。
　　 經(jīng)Illumina HiSeq2000測序后得到高通量數(shù)據(jù)，采用生物信息學分析方法對數(shù)據(jù)進行分析。首先，采用BIPES流程（Perl語言編寫，專用于分析高通量測序數(shù)據(jù)的流程）處理原始序列。包括四步，第一步，拼接序列。根據(jù)每個樣品引物上的Barcode識別雙末端測序的原始序列，用Perl腳本語言把雙

8、末端測序序列分別放入FQ文件1和2里，然后采用Needleman-Wunsch（NW)算法進行全局比對，對V6區(qū)片段進行拼接，拼接過程中，發(fā)生錯配時，根據(jù)序列測序質(zhì)量沿著5'-3'逐漸下降，我們選擇靠近5'端的堿基為準。第二步，去除引物，得到16S rRNA V6片度。第三步，質(zhì)量控制。通過對標準品計算測序錯誤率，對本次測序精確率進行初步評估。評估合格后，我們會去除一個或多個模糊不清的序列(N);去除引物上含有任何錯誤的序列;去除在40

9、-70位點發(fā)生一個以上堿基錯配的序列;去除拼接序列長度小于50-bp和大于90-bp的序列。第四步，將得到的干凈序列用UCHIME篩選嵌合體并去除嵌合體序列。
　　 其次，采用分階段聚類算法Two-Stage-Clustering(TSC)將干凈序列聚類成操作分類單元(OTUs)，出現(xiàn)頻率大于等于3次的序列采用嚴格的分層聚類算法，NW距離采用最遠距離法;出現(xiàn)頻率小于3次的序列采用貪婪聚類算法，NW距離采用最遠距離法。TSC聚類方

10、法保持對高豐度序列高精確度聚類，同時也保持低豐度序列的多樣性，從而達到緩和測序與PCR錯誤的作用。最后采用Global Alignment for Sequence Taxonomy(GAST)算法對OTUs進行分類。采用UCLUST算法計算得到α多樣性指數(shù)。根據(jù)UniFrac距離，采用QIIME進行主成分分析。采用LefSe在線工具追蹤不同組別中特殊的微生物物種，并采用非參數(shù)秩和檢驗算法進行統(tǒng)計分析。其余所有的統(tǒng)計分析均采用SPSS1

11、7.0進行分析。
　　 2、實驗二
　　 將24只雄性BALB/C小鼠隨機分為3組（8只/組），保證每組小鼠的體重分布相一致，即羅紅霉素組(ROX)、阿奇霉素組(AZI)和對照組(CK)。本實驗分為四個時期，分別是給藥前期（3天）、灌胃期（5天）、給藥期(20天)和停藥期（30天）。羅紅霉素(ROX)組，小鼠給藥劑量為0.043g每千克體重。阿奇霉素(AZI)組，小鼠給藥劑量為0.072g每千克體重。對照組(CK)，灌胃

12、0.2毫升ddH2O。三組的灌胃頻率為每天上午灌胃一次。所有糞便樣品在灌胃前收集。DNA提取、PCR擴增、PCR產(chǎn)物質(zhì)控測序、PCR產(chǎn)物測序和數(shù)據(jù)分析與“實驗一”相同。
　　 結(jié)果:
　　 1、實驗一
　　 1.1 一共收集560個糞便樣品，經(jīng)BIPES流程分析得到2921901條序列，質(zhì)控后得到2602251條序列，采用UCHIME剔除嵌合體后得到2578873條序列，unique后序列有847909條，最后經(jīng)

13、TSC聚類得到122436個OTUs。
　　 通過對所有樣品歸一化后，運用PERL腳本程序得到Shannon多樣性指數(shù)，Shannon多樣性指數(shù)顯示黃連素、環(huán)丙沙星和甲硝唑均降低小鼠腸道菌群豐度和均度，降低小鼠腸道菌群α多樣性以甲硝唑最強烈，黃連素次之，環(huán)丙沙星最低。停止口服黃連素和環(huán)丙沙星，腸道菌群α多樣性恢復(fù)至對照組水平，停止口服甲硝唑1個月，腸道菌群α多樣性仍不能恢復(fù)至對照組水平。值得注意的是，口服黃連素第2天后，Shan

14、on指數(shù)開始恢復(fù)，與之對應(yīng)的，口服甲硝唑第4天后，Shanon指數(shù)開始恢復(fù)。
　　 1.2 所有糞便樣品經(jīng)Illumina測序后得到原始序列，經(jīng)過TSC聚類和GAST分類得到OTUs，提取OTUs代表序列與參考數(shù)據(jù)庫比較得到UniFrac距離，采用QIIME對距離進行主成分分析得到聚類結(jié)果。未加權(quán)的PCoA結(jié)果顯示，給藥期間黃連素組和甲硝唑組樣品與對照組明顯地分離，環(huán)丙沙星組樣品和對照組沒有完全分離。口服黃連素、環(huán)丙沙星和甲硝唑

15、對小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響程度不一，甲硝唑最強烈，黃連素次之，環(huán)丙沙星最弱。停止口服環(huán)丙沙星3周，腸道菌群結(jié)構(gòu)恢復(fù)至對照組水平，停止口服黃連素1個月，腸道菌群結(jié)構(gòu)恢復(fù)至對照組水平，停止口服甲硝唑1個月，腸道菌群仍不能恢復(fù)至對照組水平。其次，加權(quán)與未加權(quán)的PCoA結(jié)果非常相似，給藥期間，除了環(huán)丙沙星組外，黃連素組和甲硝唑組與對照組的樣品明顯地分離，這說明了口服黃連素、環(huán)丙沙星和甲硝唑主要影響小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)高豐度的OTUs，與之對應(yīng)，對低豐

16、度OTUs影響較少。
　　 1.3 所有樣品可以分類到39個樣品，其中98.86％的序列集中在厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門（Actinobacteria）?？诜S連素和甲硝唑均促使小鼠腸道菌群的厚壁菌門（Firmicutes）和放線菌門(Actinobacteria)減少，變形菌門（Proteobacteria）增加?？诜h(huán)丙沙星，厚

17、壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）無明顯變化。停止口服黃連素、環(huán)丙沙星和甲硝唑，放線菌門（Actinobacteria）反而增加。值得注意的是，黃連素和環(huán)丙沙星干擾，擬桿菌門（Bacteroedetes）無明顯變化，甲硝唑干擾可使擬桿菌門明顯下降。
　　 1.4 變形菌門綱水平上，口服甲硝唑過程中，γ-變形桿菌（Gammaproteobacteria

18、）和β-變形桿菌（Betaproteobacteria）增加，其中，γ-變形桿菌（Gammaproteobacteria）增加最顯著?？诜S連素過程中，γ-變形桿菌（Gammaproteobacteria）和β-變形桿菌（Betaproteobacteria）增加最顯著，增加幅度遠小于甲硝唑?？诜h(huán)丙沙星期間，變形菌綱無明顯變化。
　　 許多重要的病原菌屬于γ-變形桿菌綱（Gammaproteobacteria），甲硝唑組的γ-

19、變形桿菌綱增加最顯著，增加幅度最高為39.47％，整個給藥期，平均增加幅度維持在29.54％，停止口服甲硝唑，γ-變形桿菌綱逐漸減少，平均增加幅度維持在9.34％。這為口服甲硝唑增加病原菌定植風險提供了一定的數(shù)據(jù)支持。
　　 1.5 選取豐度最高的前十位細菌屬，計算這十種細菌屬占總細菌屬的百分比。屬水平分布圖顯示，口服黃連素，小鼠腸道菌群中埃氏菌（Escherichia）、擬桿菌（Bacteroides）、乳桿菌（Lactoba

20、cillus）、parabacteroides豐富度增加，嗜膽菌（Bilophila）和埃格特菌（Eggerthella）豐富度減少。停止口服黃連素，以乳桿菌（Lactobacillus）顯著性增加為主，其他細菌逐漸恢復(fù)。與環(huán)丙沙星和甲硝唑相比，給藥期和停藥期間，擬桿菌（Bacteroides）和乳桿菌（Lactobacillus）顯著增加，未觀察到新的細菌增加或定植，這是黃連素對小鼠腸道菌群作用最有代表性的特點。
　　 口服環(huán)

21、丙沙星，小鼠腸道菌群中擬桿菌（Bacteroides）和Parabacteroides豐富度增加，螺桿菌（Helicobacter）和Papillibacter豐富度減少，細菌發(fā)生變化幅度并不顯著。停止口服環(huán)丙沙星，以乳桿菌（Lactobacillus）、埃格特菌（Eggerthella）、和Alstipes反彈性增加為主，其他細菌屬逐漸恢復(fù)。
　　 口服甲硝唑，小鼠腸道菌群中埃氏菌（Escherichia）、腸球菌（Enter

22、ococcus）和類芽孢桿菌（Paenibacillus）豐富度增加，擬桿菌（Bacteroides）、埃格特菌（Eggerthella）、Alistipes、Papillibacter、嗜膽菌（Bilophila）、Sporobacter豐富度減少。停止口服甲硝唑，以擬桿菌（Bacteroides）、乳桿菌（Lactobacillus）、埃格特菌（Eggerthella）和Alistipes反彈性增加為主。與黃連素相比，口服甲硝唑1周

23、后開始，小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)開始恢復(fù)，除了原有的細菌恢復(fù)外，發(fā)現(xiàn)新的細菌屬出現(xiàn)和增加，在給藥期第4天，觀察到類芽孢桿菌（Paenibacillus）和梭菌屬（Clostridium）新出現(xiàn)并持續(xù)增加，梭菌屬增加詳見LEfSe結(jié)果部分。
　　 1.6 采用LEfSe對小鼠腸道差異性細菌進行統(tǒng)計分析，結(jié)果顯示，口服黃連素過程中，一共有8組細菌增加，為小鼠腸道菌群豐富度增加的細菌標志物，具有統(tǒng)計學意義，LDA值為2.0。8組細菌分別為埃希

24、菌屬（Escherichia）（從門到屬）、擬桿菌屬（Bacteroides）（從科到屬）、乳桿菌屬（Lactobacillus）（從綱到屬）、腸球菌屬（Enterococcus）（從綱到屬）、Sporobacter、Parabacteroides和Bryantella。與之對應(yīng)，一共有5組細菌減少，即嗜膽菌屬（Bilophila）、Eggerthella（從門到屬）、Alistipes（從科到屬）、Mucispirillum（從門到屬

25、）、普氏菌（Prevotella）（從科到屬）和Allobaculum。
　　 口服環(huán)丙沙星，一共有7組細菌增加，即擬桿菌屬（Bacteroides）（從科到屬）、Parabacteroides、Sporobacter、毛螺菌屬（Lachnospira）、不動桿菌屬(Acinetobacter)（從門到屬）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）從綱到屬）和莫拉菌屬（Moraxella）（從綱到屬）。與之對應(yīng)，有2種細菌減少

26、，它們分別是Astipes（從科到屬）和Anaerotruncus，其減少的幅度不顯著。
　　 口服甲硝唑，一共有4組細菌增加，即埃希菌屬(Escherichia)（從門到屬）、腸球菌屬（Enterococcus）（從綱到屬）、類芽孢桿菌（Paenibacillus）和梭菌屬（Clostridium）（從科到屬）。與之對應(yīng)，一共有5組細菌減少，即擬桿菌（Bacteroides）、Alistipes（從門到屬）、嗜膽菌屬（Bilo

27、phila）（從綱到屬）、Mucispirillum（從門到屬）和Papillibacter（從門到屬）。
　　 1.7 梭菌（Clostridium）、腸球菌（Enterococcus）和腸桿菌科（Enterobacteriaceae）的大多數(shù)細菌是引起院內(nèi)感染的致病菌，是增加院內(nèi)感染風險的主要原因之一。
　　 給藥期，甲硝唑組的腸桿菌科（Enterobacteriaceae）持續(xù)增加，平均增加幅度約為29％，最高增加

28、幅度為39％，停止甲硝唑給藥2周內(nèi)，腸桿菌科增加幅度下降，最高增加幅度也達到34％，停止甲硝唑給藥2周后，腸桿菌科恢復(fù)至對照組水平。黃連素組，在給藥期間第1-5天，腸桿菌科也持續(xù)增加，但增加的幅度遠小于甲硝唑組，最高增加幅度僅為20％，值得注意的是，給藥期的第五天后和停藥期，腸桿菌科基本上不增加。
　　 給藥過程中，甲硝唑組的腸球菌（Enterococcus）也同樣持續(xù)增加，最高增加幅度為20％，黃連素僅在給藥期的第1-2天增加

29、，其余時間點，腸球菌無明顯增加。
　　 在給藥期的1周后，甲硝唑組的梭菌（Clostridium）突然出現(xiàn)并增加，一直持續(xù)至停藥后第4天。黃連素組的梭菌沒明顯變化。
　　 由Shannon指數(shù)、PCoA結(jié)果和科屬水平分析結(jié)果可知，甲硝唑組在給藥期的1周后，小鼠腸道菌群開始恢復(fù)，除了原來的細菌的數(shù)量和種類得到恢復(fù)外，出現(xiàn)了新的細菌增加，即類芽孢桿菌（aenibacillus）和梭菌（Clostridium）。黃連素在給藥期

30、的1周后，小鼠腸道菌群也開始恢復(fù)，但是，黃連素組沒有出現(xiàn)新的細菌增加，僅僅是原來的細菌數(shù)量和種類恢復(fù)。
　　 環(huán)丙沙星組的梭菌（Clostridium）、腸球菌（Enterococcus）和腸桿菌科（Enterobacteriaceae）均無明顯的增加，環(huán)丙沙星能夠很好的抑制梭菌、腸球菌和腸桿菌科細菌增加，有效地阻止梭菌、腸球菌和腸桿菌科細菌在小鼠腸道定植。
　　 2、實驗二
　　 2.1 一共收集了396個糞便

31、樣品，經(jīng)過Illumina測序后，采用BIPES流程分析得到2969614條序列，質(zhì)控后得到2636857條干凈序列，采用UCHIME剔除嵌合體后得到2601081條序列，unique后的序列有989026條，最后經(jīng)TSC聚類得到181282個OTUs。
　　 通過對所有樣品歸一化后，運用QIIME工具計算，得到Shannon多樣性指數(shù)和Observed OTUs，結(jié)果顯示羅紅霉素和阿奇霉素對小鼠腸道菌群的α多樣性的作用是相似的

32、?？诜_紅霉素和阿奇霉素，小鼠腸道菌群豐度和均度降低，而且具有較長的后效應(yīng)。停止口服羅紅霉素和阿奇霉素1個月，腸道菌群α多樣性不能恢復(fù)至原來的狀態(tài)。
　　 2.2 從β多樣性的角度，羅紅霉素和阿奇霉素長期給藥對小鼠腸道菌群β多樣性的作用是相似的，羅紅霉素和阿奇霉素長期給藥使腸道菌群結(jié)構(gòu)發(fā)生顯著改變。未加權(quán)的PCoA結(jié)果顯示，給藥期和停藥2周內(nèi)，大環(huán)內(nèi)酯類抗生素組和對照組樣品明顯分離。停止口服羅紅霉素和阿奇霉素，處理組樣品與對照組

33、的UniFrae距離逐漸減少，停止給藥1個月，小鼠腸道菌群結(jié)構(gòu)仍未完全恢復(fù)。加權(quán)的PCoA結(jié)果顯示，給藥期和停藥期，羅紅霉素組、阿奇霉素組和對照組樣品交織在一起，說明了口服羅紅霉素和阿奇霉素對小鼠腸道菌群高豐度OTUs影響較小。
　　 2.3 所有樣品可以分類到40個菌門，其中98.5％序列集中在厚壁菌門（Firmicutes）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、變形菌門（Proteobacteria）和放線菌門(Acti

34、nobacteria）。從門水平角度，口服羅紅霉素和阿奇霉素過程中，厚壁菌門增加，擬桿菌門和變形菌門減少。不同的是，停止口服阿奇霉素，厚壁菌門繼續(xù)增加，變形菌門繼續(xù)減少。
　　 2.4 選取豐度最高的前十位細菌屬，計算這十種細菌屬占總細菌屬的百分比，屬水平分布圖結(jié)果顯示，口服羅紅霉素期間，以埃氏菌（Escherichia）、Alistipes、Parabacteroides、和Anaerotruncus增加為主，與之對應(yīng)，擬桿菌

35、屬（Bacteroides）和嗜膽菌（Bilophila）豐富度減少。口服阿奇霉素期間，以Parabacteroides、Papillibaeter和Alistipes增加為主，與之對應(yīng)，擬桿菌屬(Baeteroides)、嗜膽菌(Bilophila)和乳桿菌（Lactobaeillus）豐富度減少。
　　 2.5 采用LEfSe對羅紅霉素組和對照組的差異性菌屬進行統(tǒng)計分析，LDA值設(shè)置為2.0。在屬水平，羅紅霉素干擾過程中，以

36、埃希菌屬（Escherichia）（從綱到屬）、Anaerotruncus和Anaerostipes（從門到屬）增加為主，與之對應(yīng)為，擬桿菌屬（Bacteroides）（從門到屬）、嗜膽菌屬（Bilophila）（從門到屬）、Anaerovorax(從科到屬)、螺桿菌屬（Helicobacter）（從門到屬）、Faecalibacterium、普氏菌屬（Prevotella）（從門到屬）、Mucispirillum（從門到屬）、Bull

37、eidia（從門到屬）、Eggerthella（從門到屬）和Odoribacter（從門到屬）顯著減少。
　　 對阿奇霉素組和對照組的差異性菌屬進行統(tǒng)計分析，LDA值設(shè)置為2.0。在屬水平，阿奇霉素干擾過程中，以Parabacteroides、Papillibacter（從門到屬）、Alistipes（從科到屬）和Bryantella（從門到屬）增加為主，與之對應(yīng)，擬桿菌屬（Bacteroides）（從門到屬）、嗜膽菌屬（Bil

38、ophila）（從門到屬）、乳桿菌屬（Lactobacillus）（從綱到屬）、Mucispirillum(從門到屬)、螺桿菌屬（Helicobacter）（從門到屬）和普氏菌屬（Prevotella）（從門到屬）顯著性減少。
　　 結(jié)論:
　　 1. 甲硝唑引起小鼠腸道菌群α和β多樣性降低幅度最大，黃連素次之，環(huán)丙沙星最小。停止口服黃連素和環(huán)丙沙星1個月，腸道菌群α和β多樣性恢復(fù)正常，甲硝唑則不能恢復(fù)至正常。
　

39、　 2. 甲硝唑?qū)π∈竽c道菌群干擾作用最強烈而腸道菌群的恢復(fù)力最弱，以埃氏菌、腸球菌、類芽孢桿菌和梭菌增加為主，類芽孢桿菌和梭菌是腸道菌群恢復(fù)過程中新定植并增加的細菌，引起院內(nèi)感染相關(guān)致病菌定植。
　　 3. 黃連素對小鼠腸道菌群的干擾作用小于甲硝唑，菌群恢復(fù)力卻大于甲硝唑，黃連素具有獨特的作用特點，黃連素干擾過程中，擬桿菌和乳桿菌顯著增加。停止黃連素干擾后，小鼠腸道固有細菌的數(shù)量和種類開始迅速恢復(fù)。
　　 4. 環(huán)丙

40、沙星對小鼠腸道菌群無顯著性影響，恢復(fù)力比甲硝唑和黃連素強，未觀察到院內(nèi)感染致病菌富集，以擬桿菌增加為主，從保護正常腸道菌群角度，環(huán)丙沙星優(yōu)于黃連素，黃連素優(yōu)于甲硝唑。
　　 5. 羅紅霉素和阿奇霉素長期給藥對小鼠腸道菌群的α和β多樣性的影響是相似的。
　　 6. 口服羅紅霉素和阿奇霉素，小鼠腸道菌群的α多樣性降低，腸道菌群結(jié)構(gòu)也發(fā)生顯著性改變，以擬桿菌減少為主。停止給藥一個月，腸道菌群仍不能完全恢復(fù)到原來的水平，具有很長