極地抗植物病原真菌活性菌株P(guān)KS和NRPS基因的克隆與步移.pdf

1、極地是一個(gè)微生物資源寶庫，其微生物具有種質(zhì)的新穎性和多樣性。由于極地特殊的環(huán)境特征，有可能從生存于其中的極地微生物中發(fā)現(xiàn)結(jié)構(gòu)新穎的生物活性物質(zhì)。對極地微生物活性物質(zhì)生物合成的有關(guān)功能基因進(jìn)行研究，可為從生物合成途徑深入研究其次級代謝產(chǎn)物提供分子生物學(xué)的證據(jù)，并為今后其開發(fā)利用極地微生物次級代謝產(chǎn)物的生物合成提供基因資源。
　　以尖孢鐮刀菌為指示菌，采用平板擴(kuò)散法對實(shí)驗(yàn)室保藏的38株極地活性菌株進(jìn)行了活性驗(yàn)證。研究結(jié)果表明，38株極

2、地菌株中，有13株極地菌株抑菌活性穩(wěn)定且明顯，其中菌株C-1、11W、83-1、195、2-Z18和P406抑菌效果較好。對研究獲得的抑菌活性顯著且穩(wěn)定的13株極地菌株進(jìn)行了基于16s rRNA基因的分子鑒定與系統(tǒng)發(fā)育分析。結(jié)果表明，13株活性菌株分別屬于3個(gè)屬；其中11株屬于假單胞屬(Pseudomonas)，1株屬于嗜冷桿菌屬(Psychrobacter)，1株屬于節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)。
　　分別利用簡并引物P

3、KS-D/PKS-U和NRPS-D/NRPS-U對13株極地活性菌株進(jìn)行了多聚酮合酶(PKS)和非核糖體肽合成酶(NRPS)基因的擴(kuò)增。研究結(jié)果表明，在13株活性菌株中，從5株菌株中擴(kuò)增到PKS I型KS結(jié)構(gòu)域片段，陽性率為38.5％；從10株菌株中擴(kuò)增到NRPS基因A結(jié)構(gòu)域片段，陽性率為76.9%；從5株活性菌株(C-1、P499、83-1、P406和205)同時(shí)克隆到PKS和NRPS基因，菌株C-1和P499均擴(kuò)增出2條NRPS基因

4、片段，都值得進(jìn)一步深入研究。
　　選取菌株P(guān)seudomonas sp.83-1為研究對象，利用基因步移技術(shù)對其NRPS和PKS基因兩側(cè)未知序列分別進(jìn)行了擴(kuò)增。研究結(jié)果表明，對菌株P(guān)seudomonas sp.83-1 NRPS基因成功進(jìn)行了4次步移，向其5′端共延伸5118bp；對菌株P(guān)seudomonas sp.83-1 PKS基因成功進(jìn)行了2次步移，向其5′端共延伸1622bp。對經(jīng)基因步移后獲得的NRPS基因序列進(jìn)行了OR

5、F的分析，共發(fā)現(xiàn)3個(gè)較為完整的ORF；其中ORF1編碼了NRPS模塊中的A(adenylation)域，ORF2編碼了NRPS模塊中的C(condensation)域，ORF3編碼了NRPS模塊中的1個(gè)A域和2個(gè)C域。
　　本實(shí)驗(yàn)對極地抗植物病原真菌活性菌株的PKS和NRPS基因的研究取得了一定的進(jìn)展，為從聚酮和非核糖體肽等生物合成途徑深入研究活性菌株的次級代謝產(chǎn)物提供了基因?qū)W證據(jù)，有利于進(jìn)一步了解代謝產(chǎn)物的分子調(diào)控機(jī)制，預(yù)測可能