活化型高分子量激肽原誘導(dǎo)內(nèi)皮祖細(xì)胞衰老及其分子機(jī)制的研究.pdf

1、[研究目的]
　　 高分子量激肽原(high molecular weight kininogen，HK)是血漿激肽釋放酶-激肽系統(tǒng)(kallikrein-kinin system，KKS)的主要成分之一，當(dāng)KKS活化時(shí)，HK被降解為活化型的高分子量激肽原(HKa)。眾多資料表明，KKS活化參與多種生理與病理學(xué)過程，因此認(rèn)識(shí)活化產(chǎn)物HKa的血管生物學(xué)功能具有十分重要的意義。內(nèi)皮祖細(xì)胞(EPC)是成熟內(nèi)皮細(xì)胞(EC)的前身，在促進(jìn)內(nèi)

2、皮再生和新生血管中發(fā)揮重要作用。雖然有研究表明，HKa抑制EC功能，但是HKa是否調(diào)控EPC功能不清楚。在這項(xiàng)研究中，我們檢測了HKa是否誘導(dǎo)EPCs的衰老，并對其作用的分子機(jī)制進(jìn)行了探索。
　　 [研究方法]
　　 (1)我們從人外周血分離EPC，并建立可體外培養(yǎng)的細(xì)胞株。(2)為判定HKa是否影響EPC的功能，50nMHKa處理EPCs，檢測其對EPC克隆形成及增殖能力的影響。(3)為檢測HKa是否加速EPCs衰老，

3、30-100nMHKa處理EPCs，檢測酸性β-半乳糖苷酶活性和端粒酶活性情況。(4)為研究HKa加速EPCs衰老的機(jī)制，我們分別使用10、30、50、100nMHKa處理EPCs，檢測胞內(nèi)ROS產(chǎn)生、JNK在Thr183/Tyr185位點(diǎn)和轉(zhuǎn)錄因子FOXO4在Thr451位點(diǎn)的磷酸化及p38激酶的磷酸化、錳超氧化物歧化酶和p16的表達(dá)情況。(5)為確定HKa的功能域，我們構(gòu)建了人源HK重鏈(HC，19-380aa)和輕鏈(LC，390

4、-644aa)重組蛋白，分析HKa作用的結(jié)構(gòu)域。
　　 [研究結(jié)果]
　　 (1)HKa抑制EPCs克隆形成及增殖能力。(2)HKa處理后的EPC變得大且扁平并出現(xiàn)空泡。使用酸性β-半乳糖苷酶染色法檢測，顯示HKa導(dǎo)致衰老細(xì)胞的百分比增加了2-3倍(P＜0.01)，HKa抑制EPCs端粒酶的活性。(3)HKa增加胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生，增強(qiáng)JNK在Thr183/Tyr185位點(diǎn)、FOXO4在Thr451位點(diǎn)的磷酸化以及p38激

5、酶的磷酸化，上調(diào)MnSOD和衰老分子p16的mRNA水平及蛋白表達(dá)水平。p38激酶的抑制劑SB203580，不僅減弱HKa誘導(dǎo)的p16的表達(dá)，也抑制EPCs衰老。(4)與HKa作用相似，HK的重鏈增加衰老內(nèi)皮祖細(xì)胞的百分比(63±6.6％forHKav.s.77.5±6.02％forHC)，并誘導(dǎo)JNK、FOXO4在相應(yīng)位點(diǎn)的磷酸化，及MnSOD的表達(dá)。此外，HKa和HC均能刺激胞內(nèi)H2O2的產(chǎn)生。
　　 [結(jié)論]