p85與S-2結(jié)合調(diào)控ERK-MAPK通路的活化.pdf

1、Spred(Sprout-related Ena/vasodilator stimulated phosphoprote in homology-1(EVH-1)domain)蛋白家族與Sprouty相關(guān)，包括3個(gè)主要結(jié)構(gòu)域:N端結(jié)構(gòu)域（EVH-1區(qū)），中央c-kit結(jié)合區(qū)（KBD區(qū)）和C端的半胱氨酸富含區(qū)（SPR區(qū)）。EVH1區(qū)是特異結(jié)合富含脯氨酸的序列，將蛋白錨定到特定位點(diǎn)行使功能，例如:骨架重構(gòu);肌動(dòng)蛋白調(diào)節(jié);突觸轉(zhuǎn)導(dǎo);增殖和分化

2、等。KBD區(qū)是包含一段致癌受體酪氨酸激酶c-kit的結(jié)合序列，對(duì)生長(zhǎng)因子(EGF、EPO)介導(dǎo)的ERK/MAPK的活性有抑制作用，但非必需。SPR區(qū)是非常保守的富含半胱氨酸sprouty相關(guān)序列，負(fù)向調(diào)節(jié)生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的Erk的活性。同時(shí)Spred對(duì)多種生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的Ras-ERK途徑有抑制作用。Spred蛋白家族負(fù)向調(diào)節(jié)Ras/ERK通路并影響細(xì)胞增殖和細(xì)胞分化，SPR區(qū)在該過(guò)程中起重要作用，然而其作用機(jī)制尚未闡明。本研究發(fā)現(xiàn)，磷脂酰肌

3、醇3-激酶(PI3K)的p85亞基與Spred-2蛋白的SPR區(qū)相結(jié)合。此外，SPR區(qū)的第303位、343位、353位酪氨酸共同突變不僅能夠剝奪表皮生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的Spred-2蛋白與p85亞基的結(jié)合，還會(huì)減弱Spred-2蛋白對(duì)Ras/ERK活化作用的抑制。因此與野生型相比，Spred-2蛋白突變體導(dǎo)致Hela細(xì)胞增殖加快、PC12細(xì)胞分化加強(qiáng)。進(jìn)一步的研究表明，p85亞基與Spred-2蛋白的結(jié)合能夠增強(qiáng)Ras蛋白與Spred-2蛋白

4、結(jié)合，同時(shí)還能降低Spred-2蛋白本身的泛素化，從而進(jìn)一步加強(qiáng)Spred-2蛋白的抑制作用，影響Ras/ERK活化。取得的研究結(jié)果如下:
　　 1、293T細(xì)胞經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染pRK5-Myc-Spred-2質(zhì)粒及其各段缺失體，經(jīng)饑餓、刺激等處理后通過(guò)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)和Westernblot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)p85亞基與Spred-2蛋白結(jié)合并且依賴(lài)于Spred-2蛋白的SPR區(qū)和p85亞基的SH2區(qū)。
　　 2、采用分子亞隆克技術(shù)及

5、PCR法定點(diǎn)誘變分別構(gòu)建了Spred-2蛋白SPR區(qū)第303位、343位、353位酪氨酸的單突變體，343位、353位酪氨酸的雙突變體以及同時(shí)突變?nèi)齻€(gè)位點(diǎn)的三突變體，進(jìn)行免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)和Westernblot檢測(cè)到SPR區(qū)的第303位、343位、353位酪氨酸共同突變不僅能夠剝奪表皮生長(zhǎng)因子介導(dǎo)的Spred-2蛋白與p85亞基的結(jié)合，還會(huì)減弱Spred-2蛋白對(duì)Ras/ERK活化的抑制。
　　 3、將空載體、p85亞基及其缺失體

6、分別與Spred-2蛋白和Ras蛋白共轉(zhuǎn)染，發(fā)現(xiàn)p85亞基與Spred-2蛋白的結(jié)合能夠增強(qiáng)Ras蛋白與Spred-2蛋白相互作用，同時(shí)還能降低Spred-2蛋白本身的泛素化，從而進(jìn)一步加強(qiáng)Spred-2蛋白的抑制作用。
　　 4、通過(guò)構(gòu)建空載體、Spred-2蛋白及其突變體、缺失體的重組腺病毒分別感染Hela和PC12細(xì)胞、采用臺(tái)盼藍(lán)計(jì)數(shù)法和神經(jīng)突觸伸長(zhǎng)分析發(fā)現(xiàn)與野生型相比，Spred-2蛋白p85亞基結(jié)合位點(diǎn)的突變體導(dǎo)致He

7、la細(xì)胞增殖加快、PC12細(xì)胞分化加強(qiáng)。
　　 綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)經(jīng)EGF刺激后，p85亞基被招募至Spred-2蛋白，且Spred-2蛋白的Tyr303、343及353位點(diǎn)對(duì)于EGF誘導(dǎo)的p85亞基與Spred-2蛋白的結(jié)合及Spred-2蛋白對(duì)Erk1/2活化的抑制均是必需的。p85亞基與Spred-2蛋白能夠增強(qiáng)Ras蛋白與Spred-2蛋白結(jié)合，同時(shí)還能降低Spred-2蛋白本身的泛素化，從而進(jìn)一步加強(qiáng)Spred-2蛋