囊泡轉(zhuǎn)運相關(guān)蛋白的轉(zhuǎn)運、定位機制研究.pdf

1、囊泡分泌包含一系列復(fù)雜的過程,SNARE復(fù)合體是其中的關(guān)鍵蛋白。一般認(rèn)為,SNARE蛋白之間的相互作用為啟動膜融合提供驅(qū)動力。Syntaxin1A(Stx1A)作為SNARE蛋白之一主要位于質(zhì)膜上,已被證明是囊泡融合必不可少的t-SNARE,但是它的轉(zhuǎn)運和定位機制仍然知之甚少。
　　我們設(shè)計實驗研究了Stx1A在INS-1和CHO兩種細(xì)胞系中的胞內(nèi)定位,Stx1A在這兩種細(xì)胞中的轉(zhuǎn)運和定位之前沒有被報道過。為了進(jìn)一步揭示Stx1A

2、轉(zhuǎn)運和定位的機制,我們構(gòu)建了一系列Stx1A剪切突變體,C末端用對pH值敏感的熒光蛋白pHluorin標(biāo)記。依次用pH5.5酸性外液淬滅pHluorin標(biāo)記的蛋白在細(xì)胞膜表面的熒光和用pH7.4的可透膜的NH4Cl溶液恢復(fù)胞內(nèi)pHluorin標(biāo)記的蛋白的熒光,從而定量研究STX1A在兩種細(xì)胞系中的轉(zhuǎn)運和定位。
　　我們發(fā)現(xiàn)Stx1A轉(zhuǎn)運上膜所必需的最小結(jié)構(gòu)域是其羧基端的跨膜結(jié)構(gòu)域和與跨膜結(jié)構(gòu)域相連的一些帶正電荷的氨基酸。沒有SNA

3、P25時,Stx1A上暴露的SNAREmotif會在其轉(zhuǎn)運過程中與相關(guān)蛋白發(fā)生非特異性作用并造成Stx1A突變體不能轉(zhuǎn)運上膜。由此推測與SNAP25的結(jié)合可能幫助Stx1A轉(zhuǎn)運出內(nèi)質(zhì)網(wǎng)。部分缺失Habc結(jié)構(gòu)域的突變體沒有SNAP-25時,雖然也能轉(zhuǎn)運上膜,卻不能定位到正確的功能位點。我們證明Habc結(jié)構(gòu)域決定了Stx1A的簇狀分布。我們還發(fā)現(xiàn)Munc18-1不是Stx1A形成簇狀定位所必需的。我們的實驗結(jié)果將有助于理解和進(jìn)一步研究Stx