裂殖壺菌遺傳轉(zhuǎn)化體系的研究及其在DHA合成途徑研究中的應(yīng)用.pdf

1、二十二碳六烯酸(docosahexaenoic acid，DHA)是一種極其重要的ω-3系列不飽和脂肪酸，具有抗心血管病、抗癌、降血脂、促進(jìn)智力發(fā)育和保護(hù)視力等重要生理作用。裂殖壺菌(Schizochytrium)是一類類藻的海洋真菌，因其富含DHA，有重要的經(jīng)濟(jì)價(jià)值而備受關(guān)注。對裂殖壺菌DHA合成途徑的研究將對提高裂殖壺菌的DHA含量有重要意義，因此本論文針對裂殖壺菌18S rDNA序列分析、遺傳轉(zhuǎn)化體系研究，克隆DHA合成相關(guān)基因并

2、進(jìn)行基因缺失等方面開展工作，為研究裂殖壺菌的DHA合成途徑奠定基礎(chǔ)。
　　 首先，本論文從裂殖壺菌Schizochytrium limacinum OUC88及以其為出發(fā)菌株經(jīng)紫外誘變篩選的10個(gè)菌株中擴(kuò)增出18S rDNA基因序列(序列長度為1751bp-1758bp)，與GenBank中的18S rDNA序列比對分析。結(jié)果表明，Slimacinum OUC88以及10個(gè)派生菌株與同物種的Schizochytrium sp F

3、JU-512(GenBank No.AY758384)、S.limacinum(GenBank No.AB022107)的同源性均在96％以上；與同屬異種的S mangrovei(GenBankNo.DQ100293)只有93％的同源性。并通過計(jì)算遺傳距離及構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，結(jié)果顯示種內(nèi)誘變產(chǎn)生的細(xì)微變異小于同屬內(nèi)不同物種之間的變異，表明18S rDNA序列鑒定可作為誘變、轉(zhuǎn)基因等基因工程育種后物種鑒定的有效方式。
　　 然后，作

4、為建立遺傳轉(zhuǎn)化體系的基礎(chǔ)，本論文研究Zeocin、兩性霉素B(Amphotericin B)、G418、氯霉素(Cm)、氨芐青霉素(Amp)、卡那霉素(Km)、鏈霉素(Str)七種基因工程常用抗生素對裂殖壺菌Schizochytrium limacinum生長的影響。結(jié)果表明：S limacinum對Zeocin最敏感，在2.5-4μg/ml Zeocin中成活率降至2.10-2.79％(P<0.01)；S limacinum對兩性霉素

5、B、G418、氯霉素較敏感，在14-20μg/ml兩性霉素B中的成活率降至5％以下(P<0.01)，在140μg/ml G418中的成活率為2.08％(P<0.01)，在25.5-68μg/ml氯霉素中成活率13％左右(P<0.05)；S limacinum對氨芐青霉素、卡那霉素、鏈霉素不敏感，50-300μg/ml的氨芐青霉素、卡那霉素、鏈霉素不能抑制其生長，成活率仍在80％以上(P>0.05)。本研究為裂殖壺菌基因工程篩選標(biāo)記的選擇

6、提供了實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 隨后，本實(shí)驗(yàn)參考NCBI的Genbank數(shù)據(jù)庫中報(bào)道的pks基因序列，克隆了裂殖壺菌OUC168(S limacinum OUC168)的pks1(3908bp)和pks2(4272bp)基因。采用Zeocin作為抗性篩選標(biāo)記，構(gòu)建帶有Zeocin抗性基因和部分pks基因的載體(pTEF1/Zeo-pks1-U-D、pTEF1/Zeo-pks1-M-D、pTEF1/Zeo-pks2-U-D、pTEF1/Z

7、eo-pks2-M-D)，分別pks1基因和pks2基因作為同源重組位點(diǎn)，通過電轉(zhuǎn)化，得到6株轉(zhuǎn)化菌株，經(jīng)Zeocin抗性基因擴(kuò)增及Southern blotting證實(shí)裂殖壺菌pks基因已成功實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)突變。6株轉(zhuǎn)化菌株分別為：一株pks1基因中缺失2452bp的菌株(pTEF1/Zeo-pks1-U-D轉(zhuǎn)化株，1④)，兩株pks1基因中插入Zeocin抗性基因的菌株(pTEF1/Zeo-pks1-M-D轉(zhuǎn)化株，2③和2④)，兩株pks

8、2基因中缺失2689bp的菌株(pTEF1/Zeo-pks2-U-D轉(zhuǎn)化株，3①和3④)和一株pks2基因中缺失1143bp的菌株(pTEF1/Zeo-pks2-M-D轉(zhuǎn)化株，4③)。由于基因缺失和插入突變，6株轉(zhuǎn)化菌株與S.limacinum OUC168比較，形態(tài)變化很大，細(xì)胞很小，細(xì)胞內(nèi)沒有脂肪粒，有的有異味；生長速度變慢，其中2④基本處于不生長狀態(tài)，發(fā)酵培養(yǎng)6天后生物量最多的不足S.limacinum OUC168的一半，少的僅