梅毒螺旋體鞭毛蛋白免疫活性分析及其誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶的分子機(jī)制.pdf

1、背景與目的：梅毒是由梅毒螺旋體（Treponema pallidum,Tp）引起的嚴(yán)重危害人類健康的性傳播疾病，其傳播途徑與艾滋病相同，且可明顯增加感染和傳播艾滋病的危險(xiǎn)性。近年來(lái)梅毒發(fā)病率躍居我國(guó)各類性傳播疾病之首，快速準(zhǔn)確的診斷對(duì)于預(yù)防和控制梅毒具有重要意義。迄今為止，Tp的致病機(jī)制和致病物質(zhì)仍不清楚，細(xì)菌鞭毛蛋白作為一種經(jīng)典病原相關(guān)分子模式，在促進(jìn)病原體侵襲和誘導(dǎo)宿主炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。角質(zhì)形成細(xì)胞是皮膚屏障中重要的免疫前哨細(xì)

2、胞，參與皮膚免疫炎癥反應(yīng)。因此，我們推測(cè)：Tp鞭毛蛋白可能通過(guò)誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶，進(jìn)而降解細(xì)胞外基質(zhì)，引起皮膚免疫炎癥反應(yīng)并促進(jìn)Tp侵襲。本研究旨在通過(guò)原核表達(dá)重組Tp鞭毛蛋白，分析其免疫原性和免疫反應(yīng)性，評(píng)價(jià)其是否具有候選抗原的價(jià)值。同時(shí)，以人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞為靶細(xì)胞，明確Tp鞭毛蛋白能否通過(guò)TLR5激活角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶，闡明Tp鞭毛蛋白誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶的相關(guān)信號(hào)通路。本研究將為闡明Tp分子

3、致病機(jī)制提供新思路和依據(jù)，對(duì)梅毒防控具有重要現(xiàn)實(shí)意義。
　　方法：
　　1.以Tp Nichols標(biāo)準(zhǔn)株基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增Tp鞭毛蛋白FlaB1、FlaB2和FlaB3全基因片段；構(gòu)建pET28a-FlaB1（FlaB2、FlaB3）原核表達(dá)載體；酶切、測(cè)序鑒定后，轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌E.coli BL21(DE3)中。
　　2.IPTG誘導(dǎo)重組鞭毛蛋白FlaB1、FlaB2、FlaB3表達(dá)，Western B

4、lot對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分析和鑒定；用Ni2+-NTA親和層析柱純化重組蛋白，BCA法測(cè)定蛋白濃度。
　　3.以Tp Nichols株，Chicago株和Tp臨床分離株（nhgz01和nhgz02）建立梅毒感染動(dòng)物模型，收集感染兔血清，Western Blot檢測(cè)重組鞭毛蛋白FlaB1、FlaB2、FlaB3與感染兔血清和梅毒患者血清的免疫反應(yīng)性。
　　4.重組鞭毛蛋白FlaB1、FlaB2、FlaB3免疫新西蘭兔，收集免疫血清

5、，Western Blot和ELISA法檢測(cè)重組蛋白的免疫原性和免疫反應(yīng)性。
　　5.建立重組鞭毛蛋白FlaB1、FlaB2、FlaB3 ELISA方法，檢測(cè)各期梅毒患者血清、交叉血清及陰性血清中特異性IgG和IgM，初步評(píng)價(jià)重組蛋白FlaB1、FlaB2、FlaB3在梅毒血清學(xué)診斷中的應(yīng)用價(jià)值。
　　6.培養(yǎng)人永生化的角質(zhì)形成細(xì)胞（ HaCaT），以10μg/mL FlaB1、FlaB2、FlaB3分別刺激HaCaT細(xì)胞4

6、8h后，蛋白芯片檢測(cè)基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)變化。
　　7.以不同濃度0.1、1、10μg/mL FlaB1、FlaB2、FlaB3分別刺激HaCaT細(xì)胞24h后，RT-PCR檢測(cè)MMP-9、MMP-13的mRNA表達(dá)水平，明膠酶譜實(shí)驗(yàn)和Western Blot檢測(cè)MMP-9的活性和表達(dá)水平，ELISA法檢測(cè)MMP-13的表達(dá)水平。
　　8.HaCaT細(xì)胞轉(zhuǎn)染2μg TLR5、TLR2、TLR4、MyD88特異性干擾質(zhì)粒和對(duì)照質(zhì)

7、粒后培養(yǎng)24h，隨后用10μg/mL FlaB1、FlaB2、FlaB3刺激培養(yǎng)48h，Western Blot和ELISA分別檢測(cè)MMP-9、MMP-13的表達(dá)變化。
　　9.分別用終濃度為10μg/mL的FlaB1、FlaB2、FlaB3刺激HaCaT細(xì)胞15min、30min、60min、120min后，Western Blot檢測(cè)ERK、JNK、p38磷酸化水平。
　　10.分別用終濃度為10μg/mL的FlaB1、

8、FlaB2、FlaB3刺激HaCaT細(xì)胞15min、30min、60min、120min后，Western Blot檢測(cè)細(xì)胞中總IκBα的降解水平，磷酸化IκBα的表達(dá)水平。用10μg/mL的FlaB1、FlaB2、FlaB3刺激HaCaT細(xì)胞2h后，免疫熒光檢測(cè)NF-κB p65亞基核轉(zhuǎn)位情況。
　　11.采用特異性抑制劑ERK(10μM PD98059)、JNK(20μM SP600125)、p38MAPK(10μM SB20

9、3580)、NF-κB(10μM BAY117082)預(yù)處理HaCaT細(xì)胞后，用終濃度為10μg/mL FlaB1、FlaB2、FlaB3刺激HaCaT細(xì)胞48h，Western Blot和ELISA分別檢測(cè)MMP-9、MMP-13的表達(dá)變化。
　　結(jié)果：
　　1.PCR擴(kuò)增獲得與目的片段大小相符的基因片段：FlaB1（861bp）、FlaB2（861bp）、FlaB3（858bp），重組質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序鑒定與目的基因一致。

10、>　　2.IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出相對(duì)分子量約為36kDa(FlaB1)，35kDa(FlaB2)，34kDa(FlaB3)的目的蛋白，經(jīng)Ni2+-NTA純化后BCA測(cè)定濃度約為2mg/mL。
　　3.在新西蘭兔感染Tp Nichols標(biāo)準(zhǔn)株，Chicago株及Tp臨床分離株(nhgz-01和nhgz-02)后獲取的梅毒感染兔血清，以及梅毒患者血清中均檢測(cè)到FlaB1、FlaB2和FlaB3特異性抗體的表達(dá)。
　　4.Tp鞭毛蛋白

11、FlaB1、FlaB2、FlaB3在初次免疫后7天，抗血清中即可檢測(cè)出鞭毛蛋白的相應(yīng)IgG抗體，三次免疫后獲取的免疫血清效價(jià)達(dá)到1:51200。
　　5.各蛋白IgG ELISA總的敏感性分別為：FlaB1（95.4％）、FlaB2（92.6%）和FlaB3（95.1%），在IgM ELISA中，重組蛋白對(duì)一期梅毒和先天梅毒表現(xiàn)了較好的敏感性，其敏感性分別為：FlaB1（76.8%，83.1%）、FlaB2（72.0%，87.7%

12、）和FlaB3（74.4%，89.2%）；IgG ELISA總的特異性分別為：FlaB1（98.9%）、FlaB2（95.8%）和FlaB3（95.8%），在IgM ELISA中，其特異性分別為：FlaB1（96.8%）、FlaB2（97.9%）和FlaB3（95.8%）。
　　6.鞭毛蛋白誘導(dǎo)HaCaT表達(dá)多種MMPs和TIMP，其中MMP-13，TIMP-1，TIMP-2在三組中表達(dá)量均明顯升高；僅FlaB1可誘導(dǎo)MMP-9的

13、表達(dá)量顯著升高。
　　7.FlaB1誘導(dǎo)MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)呈濃度依賴性，10μg/mL FlaB1可誘導(dǎo)MMP-9 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高。MMP-13 mRNA和蛋白表達(dá)水平也呈濃度依賴性，當(dāng)?shù)鞍诐舛冗_(dá)到10μg/mL時(shí)，可引起MMP-13 mRNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高。
　　8.HaCaT細(xì)胞轉(zhuǎn)染TLR5和MyD88干擾質(zhì)粒后可顯著抑制MMP-9、MMP-13的表達(dá)，而轉(zhuǎn)染TLR2和TLR4干擾質(zhì)粒

14、后，MMP-9、MMP-13的表達(dá)量無(wú)明顯改變。
　　9.FlaB1、FlaB2、FlaB3刺激HaCaT細(xì)胞后可誘導(dǎo)ERK、JNK、p38發(fā)生不同程度磷酸化且呈一定的時(shí)間依賴性。
　　10.FlaB1、FlaB2、FlaB3刺激HaCaT細(xì)胞后，IκBα發(fā)生不同程度的降解和磷酸化且呈一定的時(shí)間依賴性。FlaB1、FlaB2、FlaB3刺激HaCaT細(xì)胞2h后，NF-κB p65亞基發(fā)生了不同程度的核轉(zhuǎn)位。
　　11.

15、HaCaT細(xì)胞采用特異性抑制劑處理后，F(xiàn)laB1誘導(dǎo)MMP-9的表達(dá)量被顯著抑制，但是p38特異性抑制劑SB203580處理細(xì)胞后，MMP-13的表達(dá)水平與對(duì)照組比較，無(wú)顯著性差異。
　　結(jié)論：
　　1.梅毒螺旋體鞭毛蛋白FlaB1、FlaB2和FlaB3具有較強(qiáng)免疫活性，能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答，可做為梅毒血清診斷候選抗原。
　　2.梅毒螺旋體鞭毛蛋白FlaB1、FlaB2和FlaB3經(jīng)TLR5/MyD88依賴