地衣芽孢桿菌dif序列的功能鑒定.pdf

1、地衣芽孢桿菌是芽孢桿菌中較具應(yīng)用潛力的菌種之一，被廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、農(nóng)藥、食品、飼料加工、環(huán)境污染治理等各個(gè)行業(yè)。對(duì)地衣芽孢桿菌基因組進(jìn)行功能鑒定和遺傳改造方面的研究已經(jīng)成為熱點(diǎn)，而建立一種有效的基因刪除技術(shù)是對(duì)該菌株進(jìn)行遺傳改良的基礎(chǔ)。Xer/dif系統(tǒng)是普遍存在于原核生物體內(nèi)的一種位點(diǎn)特異性重組酶系統(tǒng)，dif位點(diǎn)是Xer重組酶的識(shí)別序列。大腸桿菌difEco序列和枯草芽孢桿菌difBs序列已經(jīng)被成功用于大腸桿菌和枯草芽孢桿菌多基因的刪

2、除，而在地衣芽孢桿菌中運(yùn)用Xer/dif重組酶系統(tǒng)進(jìn)行基因刪除的研究還未見(jiàn)報(bào)道。
　　 本研究在分析地衣芽孢桿菌基因組序列并獲得與枯草芽孢桿菌difBs序列十分相似的一段序列difBLi的基礎(chǔ)上，通過(guò)PCR的方法將difBLi序列引入慶大霉素抗性基因兩側(cè)，并通過(guò)引物引入Smal位點(diǎn)。將帶有difBLi序列的慶大霉素抗性基因克隆入pMD19-T載體，構(gòu)建了重組質(zhì)粒pMD19-difGm。運(yùn)用PCR的方法從B.licheniform

3、is ATCC14580染色體中擴(kuò)增出木糖異構(gòu)酶的編碼基因(xi)，將其克隆入pMD19-T載體，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19-xi。用SmaI酶切重組質(zhì)粒pMD19-dzfGm，膠回收dif-Gm-dif片段，將其克隆入重組質(zhì)粒pMD19-xi的SmaI和StuI位點(diǎn)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pMD19-xi'::difGm。用EcoRI酶切重組質(zhì)粒pMD19-xi’::difGm獲得xi’::difGm片段，將其克隆入游離型載體pHY300PLK的E

4、co RI位點(diǎn)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pHY-xi’::difGm。通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒pHY-xi’::difGm導(dǎo)入B.licheniformis ATCC14580中，篩選獲得了具有慶大霉素抗性的轉(zhuǎn)化子。在轉(zhuǎn)化子的傳代過(guò)程中，重組質(zhì)粒的慶大霉素抗性基因在體內(nèi)Xer/dif位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)的介導(dǎo)下通過(guò)其側(cè)翼的dif位點(diǎn)進(jìn)行同源重組而被準(zhǔn)確刪除。本研究確證了地衣芽孢桿菌中dif序列的功能，為地衣芽孢桿菌基因組在有限的抗生素抗性基因的介導(dǎo)下進(jìn)行