USP4通過松弛素2介導的TGF-β1-Smad2-MMP-9路徑促進乳腺癌侵襲遷移的機制研究.pdf

1、乳腺癌是中國女性發(fā)病率最高的惡性腫瘤，且發(fā)病率逐年上升，每年新發(fā)和死亡數(shù)量分別占全世界新發(fā)和死亡數(shù)的12.2%和9.6%，乳腺癌一旦發(fā)生遠處轉移，10年生存率不足10%。目前研究較熱的是乳腺癌的靶向治療，被認為是將來最有前途的治療方式，而目前缺乏明確的靶點和有效藥物，因此尋找新的靶點進而阻斷乳腺癌的侵襲轉移是乳腺癌治療亟待解決的問題。研究顯示，乳腺癌的發(fā)生發(fā)展以及轉移是多種因素共同作用的結果，其中與蛋白質降解紊亂密切相關。泛素-蛋白酶體

2、系統(tǒng)參與完成細胞內(nèi)絕大部分蛋白質的降解，是非常重要的系統(tǒng)。許多研究表明，泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在惡性腫瘤發(fā)生和轉移過程中起著重要作用。
　　目的：作為去泛素化酶家族的主要類型，泛素特異性蛋白酶（Ubiquitin-Specific Protease, USP）與乳腺癌的發(fā)生以及晚期的轉移密切相關。多種USP在乳腺癌組織中已經(jīng)被發(fā)現(xiàn)并且被證實呈高表達狀態(tài)，它們參與乳腺癌的增殖、轉移，以及與晚期乳腺癌不良預后呈正相關。USP4在多種腫瘤組

3、織中高表達并被稱為癌基因。目前ONCOMINE、Kaplan Meier-plotter數(shù)據(jù)庫是大家所公認的公共數(shù)據(jù)庫，它整合了癌癥芯片數(shù)據(jù)庫并與網(wǎng)絡結合的數(shù)據(jù)平臺，包含已發(fā)表的各類文獻和TCGA等來源的RN A和DN A序列的數(shù)據(jù)其目的在于促進發(fā)現(xiàn)全基因組表達分析。2個數(shù)據(jù)庫檢測了大約人類4800萬個基因，可對比最主要的癌癥類型和各自的正常組織的差異性表達分析，以及各種癌癥亞型分類和臨床及病理學的分析，能促進發(fā)現(xiàn)新的生物標志物和治療靶

4、點。該數(shù)據(jù)庫對于研究某個基因在疾病中的作用具有重要參考價值。因為乳腺癌的分子分型目前臨床上應用較為廣泛，所以我們通過2個數(shù)據(jù)庫研究USP4基因在乳腺癌中的表達，及 USP4與分子分型的關系，從而可以指導乳腺癌患者的治療方案，預示了乳腺癌患者的預后。TGF-β/S mad信號通路的異?；罨c腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關，尤其在腫瘤的侵襲轉移過程中發(fā)揮重要作用。最新研究發(fā)現(xiàn)TGF-β受到泛素化修飾，影響該信號通路的活化，USP家族也參與TGF-β

5、信號通路的去泛素化修飾，其中USP4可通過調控轉化生長因子受體1（TβR1）去泛素化，增強TGF-β信號通路活性，誘導乳腺癌細胞的上皮-間質轉化（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）和侵襲遷移。研究發(fā)現(xiàn)，USP4能夠提高SMAD2的磷酸化和 TGF-β基因的轉錄。但USP4如何調控TGF-β信號通路，如何調節(jié)乳腺癌侵襲和轉移的具體機制尚不清楚。松弛素近年來發(fā)現(xiàn)除了對生殖系統(tǒng)和心血管系統(tǒng)的各種作用外

6、，對腫瘤的發(fā)生發(fā)展的作用逐漸被發(fā)現(xiàn)。有研究發(fā)現(xiàn)實體腫瘤的細胞外基質通過阻斷腫瘤外的藥物擴散濃度影響治療的有效性，通過檢測在腫瘤內(nèi)的多肽激素松弛素的表達能夠提高細胞外基質的降解和提高曲妥珠單抗治療的有效性。當聯(lián)合松弛素進行曲妥珠單抗治療后，能顯著抑制腫瘤生長。也有研究發(fā)現(xiàn)松弛素是 T GF-β1介導的胞外基質合成和分泌的抑制物，跟成纖維細胞活化一樣起到作用。另外，它通過TGF-β1信號路徑介導MMP2、MMP-9降低了胞外基質的分泌。還有

7、研究發(fā)現(xiàn)松弛素在乳腺癌患者血清中濃度水平增高，尤其是轉移患者松弛素水平升高更為顯著，與預后成負相關，其中松弛素2過度表達對細胞增殖存在正相關，與TGF-β、調控纖維化等都具有一定的關聯(lián)。因目前對 USP4影響乳腺癌侵襲和轉移的機制尚沒有形成統(tǒng)一定論，所以我們深入研究USP4與松弛素及TGF-β1/S mad2/MMP-9路徑的關系，將為臨床乳腺癌患者的治療提供新的思路和希望。
　　方法：
　　1、通過ONCOMINE數(shù)據(jù)庫分

8、析USP4基因在乳腺癌組織及正常乳腺組織中的表達差異情況。通過Kaplan Meier-plotter網(wǎng)站分析USP4基因與乳腺癌患者5年和10年OS的差異。
　　2、實時熒光定量PCR檢測乳腺癌細胞株MDA-MB-231細胞、T47D細胞和正常乳腺上皮細胞MCF-10A細胞中USP4的表達量。
　　3、通過s iRN A干擾技術建立靜默USP4基因的M DA-M B-231細胞；通過質粒轉染技術建立過表達USP4基因的T4

9、7D細胞。然后分別利用RT-PCR和Western Blot方法檢測USP4的mRNA及蛋白表達情況。用Transwell侵襲實驗及劃痕實驗檢測靜默或過表達USP4基因對乳腺癌細胞侵襲和遷移能力生物學行為的影響。然后分別檢測靜默USP4基因MDA-MB-231細胞和過表達USP4基因T47D細胞中MMP-9蛋白的表達，并在過表達USP4基因T47D細胞中加入MMP-9抑制劑BB94，通過Transwell侵襲實驗及劃痕實驗檢測其侵襲和遷

10、移生物學行為的能力的變化。
　　4、在過表達USP4基因T47D細胞中用siRNA技術分別導入SiRelaxin2、SiTGF-β1、SiSmad2，通過Western Blot檢測靜默了這三種基因后Relaxin2、TGF-β1、Smad2、MMP-9蛋白表達水平變化；通過Tra ns we ll侵襲實驗、劃痕實驗檢測分別靜默Re la xin2、TGF-β1、S mad2基因后對細胞侵襲遷移生物學行為的影響。
　　結果：

11、
　　1、通過包含全基因組的ONCOMINE數(shù)據(jù)庫分析顯示：USP4基因在乳腺癌組織中表達明顯高于正常乳腺組織中（P＜0.001）。通過Kaplan Meier-plotter網(wǎng)站分析USP4基因在HER-2陽性乳腺癌患者中5年OS差異有統(tǒng)計學意義（p=0.042），在其它分子分型的乳腺癌并沒有看出生存劣勢。
　　2、USP4在乳腺癌細胞MDA-M B-231細胞、T47D細胞中高表達，在乳腺正常上皮細胞MCF-10A細胞中

12、低表達，P＜0.05，差異具有統(tǒng)計學意義。
　　3、通過RT-PCR和Western blot實驗證實能夠成功建立靜默USP4基因MDA-M B-231細胞。
　　4、劃痕實驗顯示：靜默USP4基因MDA-MB-231細胞48 h后劃痕寬度顯著大于陰性對照組（P＜0.05）；侵襲實驗顯示：靜默USP4基因M DA-MB-231細胞48 h后侵襲細胞數(shù)顯著少于陰性對照組（P＜0.05）。
　　5、通過RT-PCR和Wes

13、tern blot實驗證實能夠成功建立質粒轉染過表達USP4基因T47D細胞。劃痕實驗顯示：過表達USP4基因T47 D細胞48 h后劃痕寬度顯著小于陰性對照組（P＜0.05），侵襲實驗顯示：過表達USP4基因T47 D細胞24 h后侵襲細胞數(shù)顯著多于陰性對照組（P＜0.05）。
　　6、對過表達USP4基因的T47D細胞進行Re la xin2、TGF-β1、S mad2、MMP-9蛋白的檢測，結果顯示：Re la xin2、T

14、GF-β1、Smad2、MMP-9蛋白表達明顯提高。對靜默USP4基因的MDA-MB-231細胞進行Relaxin2、TGF-β1、Smad2、MMP-9蛋白的檢測，結果顯示TGF-β1、Smad2、MMP-9蛋白表達均顯著下降。提示USP4的表達影響Re la xin2、TGF-β1、S mad2、MMP-9蛋白的表達。
　　7、我們利用 siRNA干擾技術對過表達 USP4的 T47D細胞分別進行 Smad2、TGF-β1基因

15、的靜默，然后用 Western blot實驗對其分別進行 Relaxin2、TGF-β1、Smad2、MMP-9蛋白的檢測，結果發(fā)現(xiàn)：阻斷S mad2基因后的過表達USP4的T47 D細胞，其 Smad2、MMP-9蛋白表達與對照組相比明顯下調，卻沒有影響 Relaxin2蛋白的表達。阻斷TGF-β1基因后的過表達USP4的T47D細胞，其TGF-β1、Smad2、MMP-9蛋白的表達與對照組相比均明顯下調，也沒有影響Re la xin

16、2蛋白的表達。
　　8、我們通過siRNA干擾技術對過表達USP4的T47D細胞進行Relaxin2基因的干擾，然后用Western blot實驗對其進行檢測，結果顯示：過表達USP4的T47D細胞靜默Re la xin2基因后，其TGF-β1、S mad2和MMP-9蛋白的表達與對照組相比都是顯著降低。
　　9、Western blot結果顯示：靜默USP4基因MDA-MB-231細胞中MMP-9蛋白表達較陰性對照組顯著降

17、低(P＜0.05)，而在USP4過表達的T47 D細胞中MMP-9蛋白表達較陰性對照組表達顯著增加(P＜0.05)。對過表達 USP4的 T47 D細胞應用MMP-9的抑制劑BB94進行處理后劃痕試驗結果顯示，BB94處理的 T47D細胞的劃痕寬度顯著大于未處理組（P＜0.05）。Tra nswe ll侵襲實驗結果也表明BB94處理的過表達 USP4基因 T47D細胞的侵襲細胞數(shù)目顯著少于未處理組（P＜0.05），這提示USP4促進乳腺

18、癌細胞的侵襲能力也能夠被MMP-9的抑制劑抑制，MMP-9在USP4促進乳腺癌細胞侵襲和遷移中發(fā)揮作用。
　　10、對USP4過表達的T47D細胞分別靜默Re la xin2、TGF-β1和S imad2基因后，進行劃痕實驗，結果顯示：SiRe la xin2組、S iTGF-β1組、S iS mad2組劃痕寬度與對照組相比均明顯增寬，遷移能力明顯下降（*P＜0.05），其中 S iRe la xin2組劃痕寬度最大，差異有統(tǒng)計學

19、意義(**P＜0.01)。對 USP4過表達的 T47D細胞分別靜默Relaxin2、TGF-β1和Simad2基因后，進行Transwell侵襲實驗，結果顯示：SiRelaxin2組、SiTGF-β1組、SiS mad2組侵襲細胞數(shù)目與對照組相比均明顯減少，侵襲能力明顯下降（*P＜0.05），其中 S iRe la xin2組侵襲細胞數(shù)目最少，差異有統(tǒng)計學意義。(**P＜0.01)
　　結論：
　　1. USP4能夠促進乳

20、腺癌細胞的遷移和侵襲；
　　2. MMP-9參與USP4影響乳腺癌細胞的侵襲和遷移的過程；
　　3. USP4通過激活TGF-β1/Smad2信號通路促進MMP-9的表達，USP4通過TGF-β1/S mad2/M MP-9信號通路促進乳腺癌細胞的侵襲遷移；
　　4. USP4影響Re la xin2的表達，USP4通過Re la xin2介導的TGF-β1/S mad2/MMP-9信號通路促進乳腺癌的侵襲遷移；